猪瘟病毒浙江分离株体外生长特性及其囊膜糖蛋白E2分子的变异分析

为了研究分离于浙江省衢州和杭州的2株猪瘟病毒基因2型流行毒株QZ-07、HZ1-08在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)中的生长特性及其囊膜糖蛋白E2的分子进化特征,采用间接免疫荧光、效价测定和进化分析等分子生物学方法将基因2型流行毒株与基因1型石门株进行了比较。结果表明,石门株在PK-15细胞中的增殖效率明显高于ST细胞;感染PK-15细胞后第48小时,细胞内的效价可达107TCID50/mL,而在ST细胞中的效价只有105.25 TCID50/mL。基因2型毒株在PK-15细胞中的增殖水平明显低于ST细胞,尤其以HZ1-08株更为明显;感染ST细胞后第48小时,细胞内的效价为105 TCID50/mL,而PK-15细胞中的效价只有102.75 TCID50/mL。两基因型毒株E2的核苷酸同源性低于90%,氨基酸同源性约为90%。表明,基因2型毒株的体外生长特性及其E2的分子特性均与基因1型毒株存在差异。     

感染传染性法氏囊病病毒的DF-1细胞中chTLR3表达的动态变化

为研究鸡Toll样受体3(chTLR3)基因在传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染DF-1细胞过程中的表达情况,用3种不同毒力的IBDV感染DF-1细胞,采用实时荧光定量PCR法以及间接免疫荧光法对细胞内chTLR3基因的表达情况进行了检测。结果显示,DF-1细胞感染IBDV标准株后,其chTLR3mRNA的表达量呈增长趋势,感染后第48小时mRNA表达量达到峰值(P0.01),之后逐渐下降;DF-1细胞分别感染IBDV弱毒疫苗株与分离株后,其chTLR3mRNA表达量均出现先上升后下降的趋势,但其表达量低于标准株(P0.01)。采用间接免疫荧光法检测的chTLR3蛋白的表达变化规律与其基因的表达变化规律相同。结果证实,chTLR3参与IBDV感染DF-1细胞的过程;IBDV的毒力可影响chTLR3的表达。     

鸭γ干扰素在体外细胞中抗鸭肠炎病毒作用的研究

为初步探究鸭γ干扰素(IFNγ)抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)中扩增出鸭γ干扰素(IFNγ) cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET-32a-IFNγ。转染PCAGG-IFNγ于DEF细胞后第24小时,接种鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)。同时将pET-32a-IFNγ在大肠杆菌原核表达系统中进行蛋白表达,并用纯化产物处理DEF细胞,处理后第24小时接种DEV,分别采用Western-blot、TCID50测定方法和荧光定量PCR检测重组蛋白IFNγ对DEV复制的影响,并检测细胞中相关干扰素刺激因子(interferonstimulated genes,ISGs)基因包括抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance,Mx)、泛素样2′-5′寡聚腺苷酸合成酶基因(2′-5′oligoadenylatesynthetases-like,OASL)、DEAD框蛋白50基因(DEAD-box protein 50,DDX50)的表达情况。结果发现,无论是真核表达的还是原核表达的重组IFNγ均能抑制DEV的复制,并引起ISGs基因表达的上调。本研究结果为进一步探索鸭IFNγ的抗病毒机制提供了基础数据。     

两株乙型脑炎病毒的分离鉴定与生物学特性研究

2009年从四川多个地区的猪场采集流产死胎及库蚊样本12份,采用BHK-21细胞培养方法分离出2株乙型脑炎病毒,分别命名为JEV-CZ1与JEV-YA1,PrM/C基因与疫苗株SA-14-14-2的同源性分别为90.9%与99.6%,基因分型研究显示JEV-CZ1株为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,JEV-YA1株为基因Ⅲ型。分离株在BHK-21细胞中能产生明显的细胞病变,其细胞半数感染量(TCID50)分别为10-6.206 TCID50/0.025mL与10-4.943 TCID50/0.025mL。经脑内注射测得分离株对体重9～11g小鼠的半数致死量(LD50)分别为9.97LD50/0.1mL和6.95LD50/0.1mL,其中JEV-CZ1株毒力较强。小鼠接种分离株3～4d后出现抽搐、肢体痉挛、异常兴奋等神经症状,5～7d后全部死亡,剖检可见脑部充血、水肿;病理切片观察可见脑内神经细胞变性坏死,其他器官也出现不同程度的病变。结果表明这2个分离株符合乙型脑炎病毒的特征。     

华东地区传染性法氏囊病病毒流行株的分离及其生物学特性分析

为了解华东地区近年来传染性法氏囊病病毒(IBDV)的遗传变异现状,从该地区近三年来IBD疫苗免疫失败鸡群中分离到7株IBDV,遂被命名为J3、A4、S8、S9、A11、S14和J17。这7株IBDV均能直接适应于鸡胚培养,但对CEF、DF-1以及DF-EGFP-mi R-9三种细胞的适应性和细胞培养中的病毒效价有显著差异,较易适应于DF-EGFP-mi R-9细胞,A11毒株在DF-EGFP-miR-9细胞中的TCID_(50)高达1×10~(11)/0.1m L。用第3代鸡胚毒分别感染6周龄SPF雏鸡,均表现出临床症状和死亡情况,发病率为100%,死亡率在50%~70%之间,而用第20代细胞毒感染的SPF雏鸡,均未出现临床症状和死亡情况。将这7株IBDV分离毒VP2基因全长序列进行同源性分析,核苷酸和编码氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.6%和98.7%~99.8%。遗传进化分析显示,这7株IBDV分离毒均属于血清Ⅰ型,分布在三个相对独立的超强毒力IBDV(vvIBDV)分枝中。VP2特征性氨基酸位点分析,在第222、242、253、256、279、284、299、330、451位的氨基酸残基分别是A(S14毒株为L)、I、Q、I、D、A、S、S和L,位于第326~332位的七肽基序为SWSASGS,均具有IBDV强毒株的特征性氨基酸序列。在VP2基因高变区的第一个亲水区,J17毒株有212N,S14毒株有222L,不同于其他强毒株或弱毒株。上述研究结果表明,近年来在华东地区IBD免疫失败的鸡群中流行着超强毒力vv IBDV,毒株的生物学特性有明显差异,毒株的来源比较复杂,这对于IBD的防控面临着新挑战。     

miRNA在鸡胚胎干细胞与鸡胚成纤维细胞中表达差异的研究

为筛选在鸡胚胎干细胞(c ESCs)和鸡胚成纤维细胞(CEFs)中差异表达的micro RNA(miRNA),并探讨miRNA在维持c ESCs多能性过程中的作用,分别体外培养c ESCs、CEFs,应用miRNA芯片检测c ESCs、CEFs的miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,并采用实时荧光定量PCR进行验证,同时利用生物信息学软件对靶基因进行预测。结果显示,从已知的993条鸡miRNA中,筛选出gga-miR-1777、gga-miR-302d、gga-miR-1607、gga-miR-1599和gga-miR-1576等19条在c ESCs中高水平表达的miRNA。实时荧光定量PCR检测结果显示,gga-miR-1777、gga-miR-302d的表达与miRNA芯片结果相符。生物信息学分析显示,gga-miR-1777、gga-miR-302d的靶基因中包含细胞分化相关的基因。研究结果提示,c ESCs中高水平表达的miRNA可能通过抑制分化基因的表达来维持c ESCs的多能性。     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

靶向脑心肌炎病毒VP1基因的shRNA对脑心肌炎病毒复制的抑制作用

选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实时荧光定量PCR结果表明,4种重组EMCV VP1shRNA对EMCV的复制均有抑制作用,其中X109-2的抑制作用最显著。X109-2转染BHK21细胞后分别接种EMCV、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型脑炎病毒(JEV),EMCV的lgTCID50为3.5,FMDV和JEV的lgTCID50均在7.0以上,说明重组shRNA质粒对EMCV复制的抑制具有明确的特异性和干扰的靶向性。X109-2和pEGFP-VP1真核表达载体共转染CHO-K1细胞后,RT-PCR和Western-blot检测结果表明,VP1shRNA可抑制pEGFP-VP1在细胞中的蛋白表达,进一步证明了干扰载体的靶向性。上述结果为进一步研究EMCV的感染和复制机制奠定了基础。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly (I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDV M蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。     

伪狂犬病病毒HNX株增殖特性及其致病性的研究

将伪狂犬病病毒(PRV)HNX株和经典Ea株分别接种PK-15和Vero细胞,观察细胞病变情况,用TCID50法检测HNX株的病毒效价并绘制一步生长曲线。将15头50日龄的PRV阴性仔猪随机平均分为3组,其中2组分别滴鼻接种1mL 107 TCID50的HNX株和Ea株病毒,第3组滴鼻接种1mL DMEM培养液作为空白对照。结果显示,HNX株和Ea株在这2种细胞中产生的CPE差异明显。病毒一步生长曲线显示,HNX株早期增殖速度明显比Ea株快。动物试验结果显示,接种HNX株的试验猪临床症状典型,体温和排毒量明显高于Ea株组,HNX株的致死率为60%(3/5),Ea株的致死率为0。HNX株造成的病理损伤比Ea株严重。结果表明,HNX株能快速适应宿主细胞,相关增殖特性发生明显改变,并且对仔猪的致病性明显增强。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在杆状病毒表达系统中的双表达

为了研制针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的新型疫苗,将IBDV的VP2基因和鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因分别插入到双表达载体pFastBacDual的启动子P10和PH的下游,构建重组转移质粒pFastBacDual-VP2-IL-18。将其转座入大肠杆菌DH10Bac,获得了重组杆状病毒质粒,然后在昆虫细胞Sf9中双表达VP2-IL-18蛋白,并对双表达的VP2-IL-18进行生物学活性测定。结果显示,同一细胞中能分别表达出VP2蛋白和鸡IL-18蛋白,且表达的蛋白位于细胞胞质内。当VP2-IL-18的质量浓度为200ng/mL时能刺激鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ,IFN-γ的活性最高可达2.8×104 U/mL。当VP2-IL-18诱导产生的IFN-γ的浓度≥10U/mL时就能产生抑制水泡性口炎病毒的效果。结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18可以产生较强的生物学活性,为研制新型传染性法氏囊病IBD疫苗奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(HA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。     

DF-1细胞中泛素-蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响

为研究DF-1细胞的泛素-蛋白酶体系统(UPS)是否参与新城疫病毒(NDV)在细胞中复制的过程。使用Western-blot检测感染NDV Herts/33毒株的细胞样品以判断细胞内泛素化蛋白水平的变化,并检测NDV感染对细胞26S蛋白酶体水解活性的影响。检测泛素-蛋白酶体系统抑制剂对NDV感染后细胞上清中病毒滴度的影响,以及抑制剂MG-132对NDV在细胞中生长状况的影响。结果显示,虽然感染NDV后DF-1细胞内泛素化蛋白水平并未发生明显变化,但26S蛋白酶体的活性显著升高;使用泛素-蛋白酶体系统抑制剂可以抑制NDV在DF-1细胞中的复制。本研究结果证明DF-1细胞内泛素-蛋白酶体系统参与了NDV在DF-1细胞中的复制过程。     

猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用

通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。     

传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备及其抗病毒活性的分析

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。用间接免疫荧光试验和病毒中和试验分别测定McAb的特异性和抗病毒活性,杂交瘤细胞株2C8分泌的McAb具有较高的抗IBDV活性,培养上清液中的抗体中和效价为210,诱生BALB/c小鼠腹水中的抗体中和效价达到107,抗体亚类为IgG1κ。将2C8-McAb制成注射液,经肌肉注射,在12h内,鸡血液循环中的鼠源McAb达到高峰,半衰期至少可持续14d。在IBD预防试验中,注射2C8-McAb的鸡可抵抗IBDV强毒感染。在IBD治疗试验中,对IBDV强毒感染发病鸡用2C8-McAb治疗,存活率为60%(18/30),第21天检测法氏囊组织IBDV全部为阴性;而非治疗对照组,发病鸡的存活率只有20%(6/30),第21天检测存活鸡法氏囊组织IBDV全部呈阳性。本试验结果表明,高中和活性的2C8-McAb对IBD具有良好的预防及治疗效果,能够显著降低死亡率,并且McAb治疗康复鸡不带毒。     

湖南地区猪圆环病毒2型的分离与鉴定

为分离鉴定湖南地区2个猪场的猪圆环病毒2型(PCV2),从临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体采集组织病料,验证为PCV2感染的病料,用无污染猪肾细胞系(PK15)细胞分离培养。采用间接免疫荧光试验(IFA)、分子克隆及生物信息学等方法对分离病毒进行分析。结果显示,分别获得了2株PCV2:1株为PCV2d(命名为ChenZ-2-1,GenBank号MH718995),另1株为PCV2b(命名为Yi Y-3-27,GenBank号KU317482),且两分离株的病毒效价TCID50分别为1×10~(5.66)/mL和1×10~(5.5)/mL。本研究有利于提高PCV2的诊断水平,对深入研究PCV2的发病机理及开发PCV2新型疫苗奠定基础。     

甘草酸二钾体外抗鸡传染性法氏囊炎病毒的作用机制

利用鸡胚成纤维细胞(CEF)体外培养系统,通过观察细胞病变(CPE)和用MTT法测定细胞活力这两种方法来评价甘草酸二钾体外抑制鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)对CEF的感染作用,并通过甘草酸二钾对病毒复制、吸附的阻断作用测定试验及直接灭活病毒测定试验,初步探讨了甘草酸二钾的抗病毒机制。结果显示,甘草酸二钾在安全浓度范围内对病毒感染细胞的抑制率达到70%以上,EC50为663.2±268.4μg/mL,SI>4.52;在阻断病毒复制、直接灭活病毒的试验中,甘草酸二钾显示了较强的抗病毒能力,但在阻断病毒吸附试验中却没有作用,推测其抗病毒机制可能是干扰了病毒的复制和直接使病毒灭活。提示,甘草酸二钾能够作为预防及治疗传染性法氏囊炎的药物或先导化合物。     

Rab10对禽偏肺病毒C型复制影响的研究

为探究Rab10对禽偏肺病毒C型（aMPV/C）在A549细胞中复制的影响,将pCMV-GFP-Rab10转染A549细胞后接种aMPV/C,并进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示,Rab10和aMPV/C在细胞质中存在多个共定位荧光点,而未接毒对照中未观察到aMPV/C信号和共定位荧光点。用Image J软件进行共定位系数分析,结果显示,Rab10与aMPV/C的共定位系数极显著高于未接毒组（P<0.05）;将pCMV-Flag-Rab10、p CMV-Flag、siRab10以及siNC分别转染A549细胞后接种aMPV/C,48 h后收集上清和细胞样品,分别采用荧光定量PCR(q PCR)、Western-blot和TCID50检测aMPV/C N基因转录水平、aMPV/C N和Rab10蛋白的表达水平以及病毒效价。结果显示,过表达Rab10后aMPV/C N基因转录水平、Rab10和N蛋白表达水平以及病毒效价均极显著升高（P<0.05）;相反,干扰Rab10表达后N基因的转录水平、Rab10和N蛋白的表达水平以及病毒效价均极显著降低（P<0.05）。这些结果表明...