猪附红细胞体a1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1编码基因a1的遗传变异规律,根据GenBank上登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列(登录号AM265536)设计合成1对引物,从上海市3个屠宰场采集自然感染猪附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA作为模板,进行a1基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,共获得了41条猪附红细胞体a1基因片段序列,序列长度均为1 657bp;同源性分析显示,它们与GenBank中登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的相似性在97.7%~99.9%之间,氨基酸序列的相似性在99.1%~99.8%之间。系统进化分析表明,多数上海市猪附红细胞体分离株的a1基因与GenBank中登录的德国54/96分离株a1基因序列在同一个聚簇上。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

小附红细胞体的分离鉴定及其对猪的人工感染试验

采用2对附红细胞体种特异性引物,对上海地区2个屠宰场采集的736份猪血液基因组DNA进行PCR检测,将小附红细胞体特异性引物扩增产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定和生物信息学分析。将小附红细胞体阳性血液分离物肌肉注射给5头切除脾的断奶广西巴马小型猪仔猪,感染后定期采血,进行显微镜检,并提取基因组DNA进行PCR检测。另设3头猪作为不感染对照组,进行相同的检测。结果显示,共有101份样品检测出附红细胞体阳性,阳性率为13.72%,其中54份为小附红细胞体单独感染,占7.34%。5头巴马小型猪在接种小附红细胞体后第13~16天起,至第34天试验结束,出现明显的临床症状;血液显微镜检和PCR检测均发现存在小附红细胞体感染;其序列测定显示,16SrRNA基因的部分序列与接种的小附红细胞体的相应序列完全一致。上述结果表明,本研究成功筛选出小附红细胞体阳性血液,并成功实现了小附红细胞体对巴马小型猪的人工感染试验。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原,用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA ELISA)检测方法。结果显示,用PPA ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体,具有很高的敏感性和特异性,重复性良好,完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPVSF0 2毒株的基因组RNA为模板 ,通过RTPCR方法扩增出HN基因片段 ,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序 ;测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列 ,所测GPVSF0 2毒株与参考毒株NL 96核苷酸序列的同源性为 86 %。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同。4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽。4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%~100.0%和94.2%~100.0%。共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

牛分枝杆菌Ag85A基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以Ag85A成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得了 90 0bp的DNA片段。通过T A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体。经鉴定 ,成功地构建出了克隆载体pGEM T 85A。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。     

猪和兔附红细胞体的形态学及生殖方式观察

应用光镜和电镜对猪和兔附红细胞体的显微和超微结构进行了观察。结果表明,猪和兔附红细胞体在光镜和电镜下的形态结构、大小以及在红细胞上的附着方式等均无显著差别,其形态多为球形、卵圆形,直径0.2～2.5μm,在红细胞表面以一根或数根纤丝连接成串珠状或单个寄生。在透射电镜下,首次观察到附红细胞体边缘有一段20～30nm厚的光亮区域,并且在扫描和透射电镜下同时观察到附红细胞体的出芽生殖现象。由此推测,附红细胞体的发育方式为成熟的附红细胞体以出芽的方式产生1个未成熟形态的附红细胞体,随着未成熟形态附红细胞体的发育,逐渐从成熟附红细胞体体内脱离出来,最后以纤丝与成熟附红细胞体相连接;脱离出来的未成熟形态的附红细胞体黏附到同一红细胞或临近红细胞的膜上,最终发育成1个成熟的附红细胞体。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL 18)基因序列,设计了1对特异引物。利用RT PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增,获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序,证实已获得了新兴猪IL 18成熟蛋白基因片段,其大小为474bp,编码157个氨基酸,与GenBank上登录的猪IL 18成熟蛋白基因序列完全一致。     

猪流感病毒分离株HA基因的克隆与序列分析

从1株H3N2亚型猪流感病毒(SIV)中提取RNA,用RT-PCR方法扩增了其HA基因的全长cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果,扩增的H3N2亚型SIV HA基因长度为1 701个核苷酸,共编码566个氨基酸。核苷酸序列与已发表的中国香港、中国大陆、美国及欧洲分离的H3亚型毒株相近,核苷酸和氨基酸序列相似性均在97%以上,同属H3亚型。其HA1、HA2之间切割位点序列为PSIQSR↓G,从分子水平推论,属于非高致病力毒株。其推导的氨基酸序列中有8个糖基化位点,7个位于HA1基因的第8、22、38、63、126、165、285位点,1个位于HA2基因的154位点。研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF569597。研究结果为我国流感病毒基因库的建立、流感疫情的监测和防制提供了理论依据和技术资料储备。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因的克隆与序列分析

对鸡毒霉形体内蒙古分离株H3 株的TM 1基因进行了克隆和序列分析。根据巳发表的MGS6株TM 1蛋白基因序列分析设计了 1对引物 ,以H3 株DNA为模板进行PCR扩增 ,得到约 0 .8kb的片段 ,将该产物克隆到pUCm T载体上 ,得到重组质粒。经Kieser法、质粒PCR法、PstⅠ单酶切等方法鉴定后 ,测定H3 株TM 1基因序列 ,并与已知S6株TM 1基因序列进行了比较 ,结果表明 ,MGH3 株与S6株TM 1基因核苷酸序列同一性为 96.5 7% ,氨基酸同一性为95 .42 %。这些结果为进一步研究MGH3 株的基因免疫和基因工程疫苗等奠定了基础     

麋鹿朊蛋白全基因的克隆及序列分析

为获得中国麋鹿朊蛋白(PRNP)的全基因,并利用DNAStar软件与已报道的其他动物的朊蛋白全基因序列进行同源性分析,根据GenBank中马鹿朊蛋白基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从提取的总基因组中扩增得到麋鹿PRNP基因;将其连接到pGEM-T Easy载体中,获得克隆产物并测序。结果,成功扩增出了中国麋鹿PRNP基因,构建了重组质粒pGEM-T-ML;对克隆产物的序列分析表明,麋鹿PRNP基因的开放阅读框包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白的分子质量约为28 200u;与已报道的其他鹿科动物朊蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98.8%以上,与几种非鹿科动物的同源性在96.5%～98.4%之间。结果表明,麋鹿PRNP基因的核苷酸和编码蛋白的氨基酸序列与其他鹿科动物的序列具有高度保守性,而与几种非鹿科动物间的同源性也较高,说明朊蛋白是一种古老的高度保守的蛋白。