禽致病性大肠杆菌强毒力岛摄铁功能与致病性关系的研究

采用PCR法检测强毒力岛主要结构基因irp1、irp2、fyuA在禽致病性大肠杆菌中的分布;铬苯胺醇法检测铁载体的合成;SDS-PAGE法检测耶尔森菌摄铁蛋白HMWP1和HMWP2的表达,以半数致死量试验测定禽致病性大肠杆菌致病性与强毒力岛摄铁功能的关系。结果表明,7株禽致病性大肠杆菌强毒力岛irp1、irp2和fyuA基因的检出率为100%;铬苯胺醇平板上都能产生橙色透明晕圈;缺铁条件下,能够表达与耶尔森菌相同的摄铁蛋白HMWP1和HMWP2且半数致死量试验验证禽致病性大肠杆菌的毒力与强毒力岛摄铁功能呈正相关。证实禽致病性大肠杆菌中强毒力岛的摄铁功能与其致病性有密切的联系。     

禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛(HPI)在禽致病性大肠杆菌(APEC)中的流行情况,根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物,用PCR方法和斑点杂交法对从江苏等地分离的APEC基因组进行了扩增和检测,并对E.coliNTJC040406菌株相关基因进行了克隆和序列分析。结果表明,216株APEC中有44.9%的菌株携带有HPI,序列分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98%以上。提示HPI在APEC中广泛存在,经进一步分析,发现分离菌株是否携带HPI与O78等特定血清型有一定的相关性。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

致病性大肠杆菌O_(157):H_7基因分型的研究进展

就目前的大肠杆菌O157:H7基因分型方法进行了综述,将其归纳为3类:基于DNA的限制性酶切技术、基于特异靶标的PCR扩增技术、基于基因组特定位点的DNA多态性分析技术,阐述和分析了这些技术所涉及的方法和技术特点。认为,大肠杆菌O157:H7具有重要的公共卫生学意义,开展流行病学调查和病原溯源追踪是防控大肠杆菌病的重要手段,而基因分型是大肠杆菌O157:H7鉴定和示踪的重要技术。     

牛源大肠杆菌CTX-M型基因耐药性与流行性分析

为了解不同养殖模式下牛源大肠杆菌对抗菌药物的耐药性及CTX-M型基因流行分布特征,本研究从甘肃和新疆采集肉牛、奶牛和牦牛粪便样品,经分离鉴定得到220株大肠杆菌,采用纸片扩散法(K-B法)对分离株进行药物敏感性测定,通过PCR法检测CTX-M型基因和整合子基因型,利用多重PCR法对CTX-M阳性菌株进行种族进化关系分析...     

大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

以热灭活的大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)菌体抗原为免疫原,E.coli O157∶H7菌体结合脂多糖(LPS)为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体。采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)酶标抗体,并建立检测E.coli O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法。结果,成功制备了9株稳定分泌E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中7F9和7G2为LPS O-特异性多糖(O-SP)单克隆抗体,与E.coli O157∶H7菌体具有较好的反应性。此双抗体夹心ELISA方法对与受试的非O157菌株没有交叉反应,对E.coli O157∶H7纯培养菌液的检出下限为3×104CFU/mL。结果表明,建立的ELISA检测方法对E.coli O157具有较高的特异性和灵敏度,该方法有望与其他方法相结合用于对E.coli O157∶H7的检测。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果,将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式试验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法检测感染动物粪便中O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4天达到峰值,排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法的检测结果一致,但试纸条更简便、快捷、直观,1～5min可得出检测结果,便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。     

禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶的表达及其活性分析

为研究禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09编码的裂解酶对宿主大肠杆菌的裂解作用,克隆表达了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09的裂解酶,并检测了裂解酶的菌体内外裂解活性。利用PCR扩增了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶基因(Lysin基因),构建了重组表达质粒pET-32a(+)-LysJS09,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。在37℃IPTG浓度为1.0mmol/L诱导4h表达效果最好。重组融合蛋白LysJS09在BL21(DE3)中获得了高表达,在N端具有His标签,其分子质量约为38.9ku。重组融合蛋白以分泌型方式表达,经His-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后获得的重组蛋白LysJS09的纯度为97%。裂解活性试验表明,该裂解酶单独使用和加入EDTA(0.1mol/L)均无体外酶活性;但菌体内裂解试验表明,表达的裂解酶对宿主菌具有一定的裂解作用。     

猪链球菌1/2型的分离鉴定与致病性研究

为精准鉴定从贵州临床发病死亡猪分离到的疑似致病菌,通过形态学观察、革兰染色镜检、生化鉴定、种特异性PCR鉴定、血清型分型鉴定及毒力基因、小鼠致病性、耐药性检测,确定分离菌株为血清型1/2型猪链球菌,携带fbps⁺、mrp⁺、orf2⁺毒力基因,不具有gapdh、sly毒力基因,小鼠LD₅₀为2.0×10⁹CFU/m L,致病小鼠肺和肝可见明显病变,对氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素类和大环内酯类等多种抗生素敏感。结果表明,贵州省猪群存在致病性猪链球菌1/2型感染。     

广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布

为了解广东省发病猪、禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛(HPI)的分布和HPI阳性菌的血清型,从广东省发病的猪、禽养殖场共分离鉴定了608株大肠杆菌,针对耶尔森菌强毒力岛的标志基因irp2基因设计1对引物,对这些大肠杆菌进行了irp2基因的PCR检测;并对HPI阳性菌进行O血清型鉴定。结果显示,有105株菌含有irp2基因,即HPI阳性率为17.27%(105/608)。猪源、鹅源、鸽源、鸡源、鸭源、鹧鸪源大肠杆菌的HPI检出率分别是16.51%、17.81%、21.05%、17.74%、19.01%及0;105株HPI阳性菌的血清型分布较为分散,没有明显规律;主要的血清型有O1、O26、O45、O114、O136、O18等。研究表明,广东省猪、禽养殖场大肠杆菌的HPI携带率较高,血清型复杂。     

关中奶山羊铜绿假单胞菌的分离鉴定及其耐药性与毒力基因的检测

为对关中奶山羊乳房炎的防控提供参考,本研究采集陕西省某养殖场的奶山羊肛拭子和环境拭子共70份,并对其进行了乳房炎致病性铜绿假单胞菌的分离鉴定、耐药性检测、耐药基因鉴定和毒力基因鉴定。最终自采集的样品中共分离到26株铜绿假单胞菌,毒力基因检测显示分离的菌株携带有包括lasB、exoU和exoY在内的14种毒力基因;耐药性检测显示,分离的铜绿假单胞菌对壮观霉素和磺胺类药物高度耐药,对头孢他啶、多西环素、庆大霉素和氨苄西林等药物也具有一定程度耐药;耐药基因鉴定显示,分离的铜绿假单胞菌携带有包括氨基糖苷类药物耐药基因、超广谱β-内酰胺类药物耐药基因、碳青霉烯酶基因和氟喹诺酮类药物耐药基因在内的13种耐药基因。结果表明,铜绿假单胞菌在关中奶山羊肠道和圈舍环境中广泛存在,且相应菌株具备较强的耐药性,在养殖生产中应加强对环境的消杀工作以降低乳房炎的发病风险。     

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性.结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶茵酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10).证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有剐于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2.表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力.     

牛化脓隐秘杆菌的分离及其主要毒力基因的PCR鉴定

从2009-2012年多个奶牛场送检的5份以奶牛化脓性炎症为特征的病料中分离出5株细菌,根据其革兰氏染色的形态特征、培养特性、生化特性以及16SrRNA基因序列的BLAST分析,确定分离菌为化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes),并对分离菌的主要毒力因子基因进行了PCR鉴定和动物试验。结果显示,5株分离菌的16SrRNA基因序列与GenBank中收录的11株牛源化脓隐秘杆菌16SrRNA基因序列的同源性为99%以上。HLJ-1005株分离菌基因组中缺失胶原结合蛋白(CbpA)基因,但包含溶血素(PLO)基因、神经氨酸酶H(NanH)基因和神经氨酸酶P(NanP)基因,且HLJ-1005株分离菌的致病力明显弱于其他4株分离菌。证实,化脓隐秘杆菌的致病力与cbpA基因和nanP基因的存在相关。     

猪链球菌2型动物致病性试验研究

选取猪链球菌2型SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7和SS2-N(国外引进)株,对BALB/c小鼠、猪、兔及普通小白鼠致病性进行试验.结果SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠半数致死量(LD50)分别为2.1×106、3.1×107、5.3×107和9.4×107,SS2-N株以2.8×108活菌对BALB/c小鼠不能致病;SS2-1株对猪LD50为4.2×107,对猪半数感染量(ID50)为1.33×106,用8.0×108活菌对兔及普通小白鼠感染均不能致病.提示猪链球菌2型人工感染可引起BALB/c小鼠和猪发病;其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)的表现型与对BALB/c小鼠的致病性无相关关系;BALB/c小鼠可用于猪链球菌(2型)病疫苗免疫试验的动物模型.     

某种鸡群沙门菌的分离鉴定、毒力基因检测及单宁酸抑菌作用分析

为了解宁夏某种鸡群孵化率及雏鸡存活率下降原因,随机采集血样进行鸡白痢、鸡伤寒抗体血清学检测,同时采集死胚及死雏肝进行病原菌分离。分离病原菌通过16S rRNA和生化试验,经多重PCR鉴定禽源沙门菌血清型并检测了14种毒力基因,测定分离株对单宁酸（TA）的最低抑菌浓度（MIC）。结果显示,鸡群鸡白痢、鸡伤寒抗体阳性率为20%;试验共分离病原菌39株,其中鸡源沙门菌29株,主要血清型为鸡白痢沙门菌26株、肠炎沙门菌2株、鼠伤寒沙门菌1株;鸡白痢沙门菌对单宁酸最为敏感,MIC为0.125～1 mg/m L。本研究揭示了该种鸡群内病原菌感染情况和携带的沙门菌毒力基因,检测了单宁酸对各分离株的MIC,为单宁酸净化沙门菌的临床应用提供了参考。     

湖南省猪源粪肠球菌毒力基因的检测及部分表型的测定

采用PCR方法对湖南省分离的42株粪肠球菌的8种毒力相关的基因即溶血素基因cylA、明胶酶基因gelE、表面蛋白基因esp、胶原蛋白黏附素基因ace、聚集物质基因asa1、心内膜炎有关的抗原基因efaA以及2个假定毒力相关基因EF3314、EF0591进行了检测,并用平板法测定了这些分离株的溶血性和明胶溶解性。结果显示,24株粪肠球菌分离株普遍存在EF3314基因,检出率为100%;其次是efaA基因,检出率为92.9%;其他毒力基因gelE、ace、asa1、cylA、esp、EF0591的检出率为分别为88.1%、59.5%、52.4%、54.8%、38.1%、4.76%。菌株在绵羊血琼脂平板上以α溶血为主,而在家兔血琼脂平板中以β溶血为主,家兔血琼脂平板溶血的检出率(95.2%)高于绵羊血琼脂平板溶血的检出率(88.1%)。HN45菌株属于cylA基因阳性菌株却表现为不溶血,而19株cylA基因阴性菌株中只有YZ28菌株在家兔血琼脂平板上表现不溶血,HH57菌株在绵羊血琼脂平板上表现不溶血。5株gelE基因阴性分离株只有2株不分解明胶,37株gelE基因阳性分离株中,有32株分解明胶,5株gelE基因阳性菌株不能分解明胶。结果表明,这42株粪肠球菌中每株菌最少携带1个毒力因子基因,有些菌株最多携带7个毒力因子基因;菌株的溶血与明胶溶解的基因型和表现型并非完全一致。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR株不同代次水平的毒力比较试验

为了阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR毒株在体外传代过程中发生的毒力及遗传变异情况,采用第5、10和125代PRRSV-HBR株病毒进行了人工感染试验。结果显示,低代次(第5和第10代)病毒接种组可复制出以"高热综合征"为特点的症候群,第5代毒株感染组死亡率达40%(2/5),第10代感染组症状明显减轻且无死亡,第125代毒株感染组基本无临床症状。这3个代次的毒株感染组于感染后第3天检测病毒血症呈阳性,第7～14天到达高峰,第125代于第21天消失,较第5和10代毒株提前1周。病毒感染后抗原主要分布于脾、扁桃体、淋巴结等组织,第5和10代毒株感染组脏器出现严重的病理损伤,第125代毒株感染组仅见轻微病理损伤。对3个代次毒株的ORF5、ORF6和ORF7测序显示,仅在ORF5出现了3个氨基酸位点突变,即第29位:第5、第10代的缬氨酸到了第125代变为丙氨酸;第32位:第5、第125代的丝氨酸到了第10代变为甘氨酸;第196位:第5、第10代的谷氨酰胺到了第125代变为精氨酸。研究表明,低代次毒株能够完全复制出典型的"猪高热综合征",而高代次毒株无明显临床症状,证明该毒株经细胞传代后毒力下降。高代次毒株感染动物仍能够引起毒血症和持续感染的结果表明,高代次毒株仍具一定毒力,作为疫苗种毒需要进一步毒力弱化。     

大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.     

鸭源葡萄球菌的分离鉴定和毒力基因检测及其与致病性相关性研究

为了解广西部分地区鸭源葡萄球菌的流行状况、毒力基因分布情况及致病性,采集该地区送检病鸭组织,进行葡萄球菌分离鉴定,并用PCR方法检测7个代表性毒力基因。结果显示,自送检病料中分离鉴定出39株葡萄球菌,伪中间型葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌、猪葡萄球菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、科氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌分别有8、18、2、1、3、3、3、1株。毒力基因检测结果显示,鸭源葡萄球菌各菌种间毒力基因分布存在差异,金黄色葡萄球菌携带毒力基因较全,其次是伪中间型葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌、猪葡萄球菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌。致病性试验结果显示,金黄色葡萄球菌和伪中间型葡萄球菌均可使小鼠产生皮肤化脓、致死,比率高于其他分离菌株,表明其对小鼠有强致病力。本研究结果表明广西地区存在葡萄球菌感染,其中金黄色葡萄球菌和伪中间型葡萄球菌毒力基因分布多,且致病性强。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。