河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒隐性感染情况的调查

为了解河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的隐性感染情况,采用RT-PCR方法对2006-2009年采自全省11个地市228个县级屠宰场1 565份商品猪的肺或肺门淋巴结样品进行了PRRSV病原学检测。结果显示,PRRSV场总体阳性率为45.18%;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)样品总阳性检出率为12.08%,这4年样品的阳性检出率分别为28.45%、40.74%、12.01%和7.31%;经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)样品总阳性检出率为2.36%,这4年样品的阳性检出率分别为3.45%、3.70%、3.92%和1.46%。PRRSV同猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合感染所占的比率为59.73%,HP-PRRSV和C-PRRSV同其他病原体混合感染所占的比率分别为57.67%和43.24%,混合感染以二重或三重感染为主。在同一份样品中不能同时检测到HP-PRRSV和C-PRRSV。总之,PRRSV,尤其是HP-PRRSV在河北省猪群中隐性感染的现象普遍存在,值得高度重视。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒猪脑组织的转录组学分析

运用Illumina高通量测序技术对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的猪脑组织进行RNA-Seq测序,试图分析感染PRRSV的猪脑组织中炎症相关基因以及炎症信号通路的作用.结果 显示,PRRSV进入脑组织引起...     

干扰素压力下传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒对ISG56转录的影响

为探究猪干扰素-β(swIFN-β)加速猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异是否对病毒致病机制存在影响,将PRRSV GD07在干扰素压力下传代至第70代,同时构建SYBR Green实时荧光定量PCR方法,研究干扰素压力下传代毒株(PRRSV GDβfn)、自然条件下传代毒株(PRRSV GDfn)和原代毒株(PRRSV GDf1)等对干扰素诱导基因56(IFN-stimulated gene-56,ISG-56)转录的影响。结果显示,PRRSV能够抑制由干扰素诱导产生的ISG56的转录,其抑制能力大小依次为PRRSV GDβf20PRRSV GDf20、PRRSV GDβf50PRRSV GDf50、PRRSV GDβf70PRRSV GDf70;不同代次之间PRRSV GDf1PRRSV GDf20/PRRSV GDβf20PRRSV GDf50/PRRSV GDβf50PRRSV GDf70/PRRSV GDβf70。结果说明,构建的荧光定量方法能够检测出不同PRRSV毒株在抑制ISG56转录上的差异;随着在细胞上传代次数的增加,PRRSV GDβfn和PRRSV GDfn对ISG-56转录的抑制能力均逐渐减弱;在同一代次中,PRRSV GDβfn对ISG-56转录的抑制能力要强于PRRSV GDfn。     

猪IFN-β免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD07株在Marc-145细胞中在添加或不添加猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力条件下连续传代,将获得的新毒株进行病毒生物学分析、序列测定和IFN-βmRNA水平检测。结果显示,传代后病毒效价逐渐降低,swIFN-β对自然传代和免疫压力下传代毒株的抑制作用下降,且对swIFN-β免疫压力下传代毒株的抑制作用下降的程度较大。序列分析表明,ORF3和ORF5序列的变异导致氨基酸发生变异。荧光定量RT-PCR检测表明,swIFN-β免疫压力下传代病毒感染Marc-145细胞的IFN-βmRNA水平低于自然传代毒株的相应指标,两者均远低于poly(I∶C)刺激细胞后的IFN-βmRNA水平。结果表明,swIFN-β免疫压对PRRSV的遗传变异有正向加速作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。     

犊牛血清对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖及其活疫苗的影响

为了研究在同一培养条件下,不同含量犊牛血清(FCS)对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)JXA1-R株病毒含量的影响,以及用其生产的疫苗质量、免疫效果的变化情况,采用4个不同含量的FCS对HP-PRRSV JXA1-R株进行了繁殖,并测定病毒毒价及疫苗样品的效价,监测免疫猪的体温变化,用ELISA方法检测免疫猪PRRSV特异性抗体水平。结果显示,用15～30mL/L犊牛血清培养的病毒的含量没有较大变化,但是随血清含量的增加而略有增高。样品疫苗的病毒含量没有明显变化,但是在免疫后测温过程中发现,血清含量高的样品疫苗在接种后第2～4天体温有短暂的高温波动,随后正常。采血检测抗体发现,血清含量高的样品疫苗产生的抗体也早3～5d。本试验结果可以为HP-PRRSV的培养及疫苗工艺的改进提供有效的参考数据。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

简要介绍了国内外猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的研究进展,分析了猪繁殖与呼吸综合征疫苗研制中存在的问题和未来发展趋势,以便兽医药科技工作者全面了解猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研发及使用现状,进而指导临床应用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫学研究进展

从猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要抗原蛋白、持续性感染、细胞免疫、体液免疫和免疫抑制几方面论述了猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主之间存在复杂的免疫相互作用,旨在为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的设计与研制提供新的思路和方法。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDVM蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly(I∶C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG1...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR株不同代次水平的毒力比较试验

为了阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR毒株在体外传代过程中发生的毒力及遗传变异情况,采用第5、10和125代PRRSV-HBR株病毒进行了人工感染试验。结果显示,低代次(第5和第10代)病毒接种组可复制出以"高热综合征"为特点的症候群,第5代毒株感染组死亡率达40%(2/5),第10代感染组症状明显减轻且无死亡,第125代毒株感染组基本无临床症状。这3个代次的毒株感染组于感染后第3天检测病毒血症呈阳性,第7～14天到达高峰,第125代于第21天消失,较第5和10代毒株提前1周。病毒感染后抗原主要分布于脾、扁桃体、淋巴结等组织,第5和10代毒株感染组脏器出现严重的病理损伤,第125代毒株感染组仅见轻微病理损伤。对3个代次毒株的ORF5、ORF6和ORF7测序显示,仅在ORF5出现了3个氨基酸位点突变,即第29位:第5、第10代的缬氨酸到了第125代变为丙氨酸;第32位:第5、第125代的丝氨酸到了第10代变为甘氨酸;第196位:第5、第10代的谷氨酰胺到了第125代变为精氨酸。研究表明,低代次毒株能够完全复制出典型的"猪高热综合征",而高代次毒株无明显临床症状,证明该毒株经细胞传代后毒力下降。高代次毒株感染动物仍能够引起毒血症和持续感染的结果表明,高代次毒株仍具一定毒力,作为疫苗种毒需要进一步毒力弱化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入介体的研究进展

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵入宿主细胞的途径,介绍了PRRSV的细胞嗜性和其侵入的介体(硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素和CD163等),以及它在病毒侵入宿主细胞时所表现的生物学功能,提出了PRRSV入侵猪肺泡巨噬细胞的一般途径。     

同源重组技术在拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用

为探寻猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组的规律和机制,在反向遗传学技术平台基础上,设计了几对作为配体和供体的复制子质粒,相应配对后共转染Mar-c145细胞,经原代或传代培养后拯救出病毒,并对拯救病毒的序列进行了比对分析。结果显示,拯救的病毒为重组子,共含有供体和配体亲本部分序列;在配体和供体的同源序列区发生了分子间同源重组;重组区域存在着一定的随机性,分别依次在ORF1的256～318 nt区域、ORF5的13970～13992 nt、ORF6的14428～14494 nt及ORF7的15135～15161 nt区域发生了重组。本研究利用同源重组技术建立的重组体系,不仅揭示病毒重组区域具有随机性,而且也为其他RNA病毒的感染性cDNA克隆的构建提供了一种方法。     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6 (M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法.结果 显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。