环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

莫氏巴贝斯虫trap基因的克隆表达及反应原性分析

本研究以莫氏巴贝斯虫临潭株为研究对象,分别从其基因组D N A和c DNA中成功扩增trap基因全长,应用生物信息学分析软件分析验证了该基因和蛋白的结构;构建p ET-30a-trap原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达;表达产物超声破碎后,对上清和沉淀进行SDS-PAG E分析。纯化可溶性的r Bm TRAP,W estern-blot分析其反应原性。结果显示,莫氏巴贝斯虫trap基因具有4个内含子和5个外显子,开放阅读框大小为2 100 bp。第1~23位氨基酸为信号肽序列,第45~201和第238~302位分别为TRAP蛋白家族的v WA和TSP1结构域;重组蛋白r Bm TRAP以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株阳性血清可特异性识别r Bm TRAP,而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、吕氏泰勒虫和羊无浆体阳性血清无交叉反应。结果表明,r Bm TRAP具有作为血清学诊断方法候选抗原的潜力,为将来建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株感染的免疫学诊断方法奠定了基础。     

补体结合试验诊断环形泰勒虫病的研究

用含环形泰勒虫的血液接种除脾牛，将红细胞中的虫体制成抗原，建立了总量为０．６ｍｌ的补体结合试验方法。人工感染牛血清中的抗体在感染后５ｄ即可检出，３０ｄ达到最高峰，持续８个月。检测４３头已知感染牛，４２头呈阳性反应，检出率为９７．５６％；３５份安全区牛血清，均呈阴性，没有假阳性反应。环形泰勒虫抗原与瑟氏泰勒虫血清有轻微的交叉反应，与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛边虫、伊氏锥虫、日本分体吸虫病牛的血清无交叉反应。利用该方法对不同地区的１２７５份牛血清进行了环形泰勒虫病血清学调查，表明其敏感性、特异性良好，可用于口岸检疫、流行病学调查及临床诊断     

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白.Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法.该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应.结果表明,建立的间接EHSA方法具有良好的特异性和敏感性.     

双芽巴贝斯虫Hsp20一新基因型的发现及生物学特性分析

为了鉴定分离自甘肃永靖的1株双芽巴贝斯虫Hsp20基因型为一新基因型,参考双芽巴贝斯虫Hsp20核苷酸序列,设计特异性引物。对其进行扩增,利用生物信息学方法对其进行比对分析。结果显示,扩增获得了700 bp的核苷酸片段。与GenBank中公布的18种不同物种的氨基酸序列构建遗传发育树,结果表明本实验获得的双芽巴贝斯虫与美国株和中国新疆株的亲缘关系最近。对其氨基酸序列进行比对分析,发现在第31～85位点存在冗余,与公布的Hsp20氨基酸序列存在明显的差异。通过同源建模分析,发现该冗余致使Hsp20蛋白在第7号位形成1个环形结构,从而引起了第3号位的拉伸。通过生物信息学分析得出,获得的双芽巴贝斯虫甘肃株的Hsp20基因是一新基因型。该基因型的存在为更加准确诊断双芽巴贝斯虫病提供了依据。     

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein),采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418(4.0 mg/m L)的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。     

尤氏泰勒虫OPRT基因的优化表达

为克隆和表达尤氏泰勒虫OPRT基因的功能区片段,并对重组OPRT蛋白的反应原性进行分析,以反转录得到的尤氏泰勒虫cDNA链为模板,PCR扩增出OPRT基因片段,然后将其克隆至pET-30a(+)载体;把构建成功的重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21进行优化表达,对诱导表达的蛋白纯化后用Western-blot分析它与吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫阳性血清是否发生交叉反应。结果显示,OPRT基因获得了不可溶性表达,最佳表达时间为6h,最佳表达温度为28℃,且表达的重组OPRT蛋白分别与上述2种泰勒虫阳性血清发生交叉反应。结果表明,OPRT同源基因也存在于吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫之中。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

牛巴贝斯虫病ELISA诊断方法的建立

以BORCT蛋白为包被抗原,优化最佳反应条件,确定阈值并测定其交叉反应,建立了一种特异性检测牛巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。利用该方法测定了试验感染的2头牛的抗体动态曲线,并对我国四川、甘肃、新疆3个省(自治区)的314份牛血清样品进行了检测。结果显示,经MedCalc 12.7.3.0软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果,确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值,对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%,并且与其他巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体阳性血清均无交叉反应。对试验感染动物的检测结果显示,感染后的第6天出现特异性抗体,第12天达到最高值,一直持续到第270天。野外样品检测结果显示,3个省份均有牛巴贝斯虫的分布,平均阳性率为46.82%。     

羊巴贝斯虫SBP3基因序列分析和诊断标识潜力评价

以GenBank中公布的巴贝斯虫球状体蛋白3(spherical body protein3,SBP3)基因序列为模板,设计合成特异性引物,从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和cDNA中扩增SBP3基因全长序列;利用生物信息学分析软件,进行基因序列比对、结构特征分析和遗传进化分析,以阐明我国羊巴贝斯虫SBP3基因特性和各虫株间的分类关系;以SBP3基因作为靶标基因,建立巢式PCR检测方法,评价其作为诊断标识基因的潜力。结果显示,羊巴贝斯虫SBP3基因无内含子,其中羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株的SBP3基因全长分别为3 195 bp、3 351 bp和3 348 bp;遗传进化分析结果显示,我国分离的6株羊巴贝斯虫可分为2个种,其中莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种;以SBP3为靶标分子建立的巢式PCR可特异性鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,且与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊无浆体无交叉反应,检测羊巴贝斯虫未定种最低检测限为5 pg,检测莫氏巴贝斯虫最低检测限为0.5 pg。本试验将为进一步探究羊巴贝斯虫SBP3蛋白功能及羊巴贝斯虫流行病学调查提供数据和技术支持。     

牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的建立

为建立一种适用于基层兽医实验室特异、敏感、快速检测牛巴贝斯虫感染的方法,以牛巴贝斯虫球状体蛋白4(SBP4)基因为靶基因设计引物,建立检测牛巴贝斯虫的巢式PCR方法。结果表明,该方法可特异性地检测牛巴贝斯虫感染,与14种动物梨形虫无交叉反应。该方法能够检测到1 copy的SBP4基因,其敏感性分别是对应的内、外引物普通PCR的10倍和1 000倍。应用该巢式PCR方法,对田间随机采集的136份野外样品进行检测,检出阳性样品9份,显著高于AbouLaila等报道的方法(5份)。这些数据表明,建立的巢式PCR方法可用于基层兽医实验室敏感、准确地检测牛巴贝斯虫感染。     

建立在PCR-RFLP方法基础上的羊梨形虫的种类鉴定

羊的梨形虫病在世界范围内广泛分布,由多种泰勒虫和巴贝斯虫引起。在我国主要有莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。为了快速准确地鉴定羊梨形虫,作者运用PCR技术扩增了梨形虫的18 S rRNA基因,然后再分别用内切酶ClaⅠ、Sau96Ⅰ和MboⅡ酶切扩增产物,根据酶切后限制性片段多态性的不同,建立了PCR-RFLP方法,达到了鉴定莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫的目的,为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。     

莱姆病间接ELISA诊断方法的建立及应用

使用培养的狭义伯氏疏螺旋体B31菌株制备可溶性抗原,建立羊莱姆病血清抗体的间接ELISA诊断方法。应用伯氏疏螺旋体阴性、阳性血清评价该方法的特异性和敏感性。根据所建立的方法对从甘肃省甘南地区采集的450份羊血清进行检测。结果显示,该方法对羊莱姆病的阳性检出率和阴性符合率分别为90.1%和90.0%,与羊霉形体、布鲁氏菌、弓形虫以及羊无浆体、巴贝斯虫、泰勒虫等常见蜱传播病原的阳性血清之间没有交叉反应。甘肃省甘南地区夏河县、临潭县和卓尼县羊莱姆病的感染率分别为3.3%、6.1%和4.1%,甘南地区的平均感染率为5.1%。结果表明,本研究所建立的方法能够用于羊莱姆病的血清学诊断,甘南地区可能存在莱姆病的自然疫源地。     

环形泰勒虫微线体-棒状体基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的生物学特性,通过生物信息学分析,选取环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白特异性和抗原性最高的一段开放阅读框进行RT-PCR扩增,将所获基因片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,将表达产物纯化后免疫家兔制备该蛋白的多克隆抗体。通过SDS-PAGE和Western-blot分析该基因的原核表达情况和表达产物的反应原性。生物信息学分析发现,该蛋白第470~650位氨基酸残基的特异性和抗原性最高。对诱导条件的摸索发现,在37℃、1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h表达量最高,表达产物大小为43ku。Western-blot结果显示,该蛋白能被环形泰勒虫阳性的牛血清所识别,具有很好的反应原性。本研究制备的多克隆抗体为后期研究微线体-棒状体蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

金华市部分乡镇奶牛巴贝斯虫病的流行病学调查

为有效防控金华市奶牛巴贝斯虫病,根据牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-MSA-2c作为抗原,对2009-2011年金华市7个乡镇的奶牛巴贝斯虫病进行了流行病学调查。结果显示,金华存在奶牛巴贝斯虫病,在2009年采集的296份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为3.72%;在2010年的306份牛血清样品中检出阳性血清14份,感染率为4.58%;在2011年的307份牛血清中检出阳性血清11份,感染率为3.58%。结果提示,金华市奶牛巴贝斯虫感染率以农户散养最高,建立集约化养殖制度和家畜原虫病综合防疫措施迫在眉睫。     

肝片吸虫诊断候选抗原的筛选

旨在筛选出肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断肝片吸虫感染引起的肝吸虫病的靶点。通过蛋白免疫印迹试验从肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库中筛选出肝片吸虫特异性抗原基因,对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。克隆特异性抗原基因,并连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western-blot验证其表达情况。结果表明,共计获得了18个阳性克隆。通过候选抗原核酸序列同源性比较,发现肝片吸虫假定蛋白D915_000758具有完整的开放阅读框。经生物信息学分析,发现该蛋白cDNA全长为345 bp,编码114个氨基酸。成功扩增出该特异性抗原基因,SDS-PAGE结果表明重组蛋白pET-Fh以包涵体形式表达,分子质量大小约为32 ku;Western-blot证明该重组蛋白可以被肝片吸虫阳性血清特异性识别。结果提示,假定蛋白D915_000758可作为潜在的肝片吸虫病诊断候选抗原,应用于肝片吸虫感染引起的肝吸虫病的诊断技术中。     

含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测方法的建立

为了提高犬巴贝斯虫的PCR检测方法准确性,采用复合引物重组方法构建两端含有检测巴贝斯虫18S r RN A基因的PCR检测引物的扩增内标质粒(含鸡特异性基因片段),通过优化扩增内标质粒的添加量,建立了一种新的检测犬巴贝斯虫PCR方法。结果显示,在25 L的PCR反应体系中加入1×106copies的扩增内标的可有效地检测犬巴贝斯虫基因组D NA,该PCR方法最低检测限为1×105copies。本试验建立的含扩增内标的PCR检测方法能快速、准确、简便的检测犬巴贝斯虫感染,同时能有效的避免假阴性现象的产生。