干扰素压力下传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒对ISG56转录的影响

为探究猪干扰素-β(swIFN-β)加速猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异是否对病毒致病机制存在影响,将PRRSV GD07在干扰素压力下传代至第70代,同时构建SYBR Green实时荧光定量PCR方法,研究干扰素压力下传代毒株(PRRSV GDβfn)、自然条件下传代毒株(PRRSV GDfn)和原代毒株(PRRSV GDf1)等对干扰素诱导基因56(IFN-stimulated gene-56,ISG-56)转录的影响。结果显示,PRRSV能够抑制由干扰素诱导产生的ISG56的转录,其抑制能力大小依次为PRRSV GDβf20PRRSV GDf20、PRRSV GDβf50PRRSV GDf50、PRRSV GDβf70PRRSV GDf70;不同代次之间PRRSV GDf1PRRSV GDf20/PRRSV GDβf20PRRSV GDf50/PRRSV GDβf50PRRSV GDf70/PRRSV GDβf70。结果说明,构建的荧光定量方法能够检测出不同PRRSV毒株在抑制ISG56转录上的差异;随着在细胞上传代次数的增加,PRRSV GDβfn和PRRSV GDfn对ISG-56转录的抑制能力均逐渐减弱;在同一代次中,PRRSV GDβfn对ISG-56转录的抑制能力要强于PRRSV GDfn。     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒隐性感染情况的调查

为了解河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的隐性感染情况,采用RT-PCR方法对2006-2009年采自全省11个地市228个县级屠宰场1 565份商品猪的肺或肺门淋巴结样品进行了PRRSV病原学检测。结果显示,PRRSV场总体阳性率为45.18%;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)样品总阳性检出率为12.08%,这4年样品的阳性检出率分别为28.45%、40.74%、12.01%和7.31%;经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)样品总阳性检出率为2.36%,这4年样品的阳性检出率分别为3.45%、3.70%、3.92%和1.46%。PRRSV同猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合感染所占的比率为59.73%,HP-PRRSV和C-PRRSV同其他病原体混合感染所占的比率分别为57.67%和43.24%,混合感染以二重或三重感染为主。在同一份样品中不能同时检测到HP-PRRSV和C-PRRSV。总之,PRRSV,尤其是HP-PRRSV在河北省猪群中隐性感染的现象普遍存在,值得高度重视。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫学研究进展

从猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要抗原蛋白、持续性感染、细胞免疫、体液免疫和免疫抑制几方面论述了猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主之间存在复杂的免疫相互作用,旨在为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的设计与研制提供新的思路和方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

2021—2022年华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行特点,2021—2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF5基因测序,所有检测的毒株均属美洲型,共可以分为4个亚型,其中11个毒株属于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)(Sublineage 8.7);6个毒株属于类NADC30毒株亚型（Sublineage 1.8）;4个毒株属于类NADC34亚型（Sublineage 1.5）。病毒GP5蛋白基因测序结果显示,流行毒株GP5蛋白aa3-39及aa185-200两个高变区出现变异。该研究表明我国该地区PRRSV流行毒株存在遗传多样性,基因型复杂,需要引起我们的重视。     

巴马香猪超前免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的免疫效果评价

为了评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(JXA1-R)对仔猪超前免疫的免疫效果及安全性,给3头巴马香猪超前免疫弱毒疫苗JXA1-R 1头份/头,以3头同窝仔猪为对照组,接种等量疫苗稀释液,观察疫苗免疫后的临床表现,测定疫苗免疫后的抗体动态变化及排毒情况;免疫后第35天,采用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1)攻毒,测定攻毒后的抗体变化、排毒情况及免疫保护作用。结果表明,巴马香猪超前免疫后第14天发生抗体阳转,鼻拭子样品、肛门拭子样品和血清样品中均检测到病毒核酸,同居的阴性对照组中有1头仔猪发生抗体阳转,提示该疫苗存在排毒现象。攻毒前免疫组和对照组的抗体阳性率分别为3/3和1/3;攻毒后免疫组和对照组的免疫保护率分别为3/3和1/3,表明该疫苗具有一定的免疫保护作用,但初生巴马香猪超前免疫后表现生长缓慢,被毛粗乱,提示该疫苗对仔猪具有一定的毒力,不适合用作超前免疫。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

犊牛血清对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖及其活疫苗的影响

为了研究在同一培养条件下,不同含量犊牛血清(FCS)对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)JXA1-R株病毒含量的影响,以及用其生产的疫苗质量、免疫效果的变化情况,采用4个不同含量的FCS对HP-PRRSV JXA1-R株进行了繁殖,并测定病毒毒价及疫苗样品的效价,监测免疫猪的体温变化,用ELISA方法检测免疫猪PRRSV特异性抗体水平。结果显示,用15～30mL/L犊牛血清培养的病毒的含量没有较大变化,但是随血清含量的增加而略有增高。样品疫苗的病毒含量没有明显变化,但是在免疫后测温过程中发现,血清含量高的样品疫苗在接种后第2～4天体温有短暂的高温波动,随后正常。采血检测抗体发现,血清含量高的样品疫苗产生的抗体也早3～5d。本试验结果可以为HP-PRRSV的培养及疫苗工艺的改进提供有效的参考数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

同源重组技术在拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用

为探寻猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组的规律和机制,在反向遗传学技术平台基础上,设计了几对作为配体和供体的复制子质粒,相应配对后共转染Mar-c145细胞,经原代或传代培养后拯救出病毒,并对拯救病毒的序列进行了比对分析。结果显示,拯救的病毒为重组子,共含有供体和配体亲本部分序列;在配体和供体的同源序列区发生了分子间同源重组;重组区域存在着一定的随机性,分别依次在ORF1的256～318 nt区域、ORF5的13970～13992 nt、ORF6的14428～14494 nt及ORF7的15135～15161 nt区域发生了重组。本研究利用同源重组技术建立的重组体系,不仅揭示病毒重组区域具有随机性,而且也为其他RNA病毒的感染性cDNA克隆的构建提供了一种方法。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

简要介绍了国内外猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的研究进展,分析了猪繁殖与呼吸综合征疫苗研制中存在的问题和未来发展趋势,以便兽医药科技工作者全面了解猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研发及使用现状,进而指导临床应用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的分离与分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核酸序列,设计合成1对引物,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从病猪肺中扩增出编码核衣壳蛋白(NP)基因,克隆入T-载体后,利用双脱氧链末端终止法测定序列,所获得的序列经Bankit投放到GenBank,并利用DNASIS、Dnastar等软件进行了分析.     

安徽省猪生殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

从2006～2008年采自安徽省的高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒的病料中扩增得到7株PRRSV ORF5基因序列,并进行了序列分析和抗原位点预测.结果表明,安徽省的地方PRRSV流行毒株与VR-2332、CH-1a、JXA1毒株的氨基酸同源性为85.1%～86.1%、90.5%～92.5%、96.5%～98.5%;安徽省地方分离株之间氨基酸同源性较高,介于97.O%～98.5%之间.与2006年以前获得的毒株相比,安徽省流行毒株与JXA1、TZ、CXN-1等高致病性毒株具有相同的氨基酸突变位点(G9→C9、S16→F16、S35→N35、V94→A94、V185→A185),这些关键氨基酸位点的变异可能导致PRRSV毒力增强.对GP5蛋白表面抗原位点的预测发现,安徽省地方分离株与JXA1株存在6个主要抗原位点;与VR-2332、CH-1a毒株相比,由于抗原表位氨基酸位点的突变(A27→V27,L39→139,V185→A185,I189→L189)导致了抗原位点抗原性发生了变化.遗传进化树分析显示,安徽省地方流行毒株与JXA1、TZ等毒株具有较近的亲缘关系,推断2006～2008年安徽省流行的PRRSV毒株由同一毒株演化而来,且变异程度不大.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.