传染性法氏囊病病毒的生态学研究——非鸡禽鸟类自然感染传染性法氏囊病病毒的血清学调查

用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体夹心阻断ＥＬＩＳＡ对麻雀、鸭、鹅进行了ＩＢＤＶ血清学调查，麻雀的阳性率为７．４％（４／５４），鸭的阳性率为９５．５％（３６３／３８０），鹅的阳性率为９．４％（１１／１１７）。表明ＩＢＤＶ传播已非常广泛，提示麻雀、鸭、鹅特别是鸭在ＩＢＤＶ生态和传播中可能起重要作用。     

非鸡胚源细胞对传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

采用非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ）直接从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）死亡小鸡的法氏囊组织中分离到Ｘ毒株和Ｎ毒株，经电镜形态学观察和多项生物学特性试验的结果表明，分离到的Ｘ毒株和Ｎ毒株为传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）血清Ⅰ型     

鸡传染性法氏囊病病毒的提纯和鉴定

取鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）患鸡的法氏囊病料经氟利昂作用去除杂蛋白，并经甘油一酒石酸钾密度梯度离心进一步纯化；细胞适应毒在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上出现明显细胞病变后冻融、ＰＥＧ沉淀纯化。电镜观察、吸光庆测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）的结果表明，得到了完整形态的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,采用化学合成的方法合成ggamiR-9*模拟物,然后用其转染DF-1细胞,接种IBDV,分别收集上清液和细胞,测定IBDV的效价和干扰素(IFN)含量;进一步用生物信息学方法预测gga-miR-9*的靶基因,并分别用双荧光素酶报告系统、Western-blot、qRT-PCR和RNA干扰对其靶基因进行验证。结果显示,gga-miR-9*模拟物能够促进IBDV的复制,抑制IFN的产生;gga-miR-9*可靶向降解IRF2mRNA和抑制IRF2蛋白的翻译;IRF2被敲除的DF-1细胞感染IBDV后的复制效价(106.25 TCID50/0.1mL)高于miRNA阴性对照组的效价(105.25 TCID50/0.1mL)。结果表明,细胞gga-miR-9*促进IBDV复制的分子作用机理是在IRF2基因转录后水平上抑制细胞天然免疫功能而发生的。     

麻雀体内传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及理化特性研究

从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）阳性麻雀体内分离到了一株病毒，用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验和ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针斑点杂交试验证明该病毒为ＩＢＤＶ。病毒可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。病毒血清型鉴定为Ⅰ型，病毒代谢抑制试验证明其基因组为ＲＮＡ，病毒核酸的电泳图谱呈两条特征带。病毒对乙醚不敏感，ｐＨ２．０不能灭活病毒，ｐＨ１２可使病毒失去感染性，５６℃作用３小时病毒仍有活性，７０℃１小时可灭活病毒。以上结果表明从麻雀体内分离到的ＩＢＤＶ理化性质比较稳定，与目前鸡场流行的ＩＢＤＶ极为相似，可能与鸡ＩＢＤＶ同源，提示麻雀可能在ＩＢＤ流行病学中起主要作用。     

贵州省传染性法氏囊病病毒野毒株核酸及结构蛋白比较研究

采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀，再经差速离心和蔗糖密度梯度离心，从病变法氏囊组织中提取出较纯的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。病毒核酸电泳分析表明，４株ＩＢＤＶ分离株均由双节段ＲＮＡ组成，大小基因片段的电泳迁移率毒株间无差异。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明，ＩＢＤＶ分离株均由４条主要的结构蛋白带组成。近年从免疫鸡群中分离的地方强毒ＪＨ株及引自中监所的血清Ⅰ型强毒Ｊ＿１Ｃ＿７株，其主要结构蛋白带与早年分离的ＩＢＤＶ野毒株相似，电泳迁移率也基本一致。同时观察到毒株间各蛋白带相对百分含量的变化。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）组织毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ、病毒中和试验检测分泌抗体，获得了６株稳定分泌抗ＩＢＤＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞，命名为ＮＩＢ－１，ＮＩＢ－２，ＮＩＢ－３，ＮＩＢ－４，ＮＩＢ－５，ＮＩＢ－６；６株ＭｃＡｂ均具ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，亚类鉴定表明，前４株属于ＩｇＧ_（２ａ），后２株属于ＩｇＧ_１。杂交瘤细胞冻存６个月后复苏，均能稳定分泌特异性ＭｃＡｂ。     

传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备及其抗病毒活性的分析

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。用间接免疫荧光试验和病毒中和试验分别测定McAb的特异性和抗病毒活性,杂交瘤细胞株2C8分泌的McAb具有较高的抗IBDV活性,培养上清液中的抗体中和效价为210,诱生BALB/c小鼠腹水中的抗体中和效价达到107,抗体亚类为IgG1κ。将2C8-McAb制成注射液,经肌肉注射,在12h内,鸡血液循环中的鼠源McAb达到高峰,半衰期至少可持续14d。在IBD预防试验中,注射2C8-McAb的鸡可抵抗IBDV强毒感染。在IBD治疗试验中,对IBDV强毒感染发病鸡用2C8-McAb治疗,存活率为60%(18/30),第21天检测法氏囊组织IBDV全部为阴性;而非治疗对照组,发病鸡的存活率只有20%(6/30),第21天检测存活鸡法氏囊组织IBDV全部呈阳性。本试验结果表明,高中和活性的2C8-McAb对IBD具有良好的预防及治疗效果,能够显著降低死亡率,并且McAb治疗康复鸡不带毒。     

应用间接酶联免疫吸附试验检测鸡传染性法氏囊病病毒

用制备的抗鸡ＩｇＧＭｃＡｂ－ＨＲＰ作为免疫试剂，以ＩＢＤＶ的高免阳性鸡血清作为抗体，用间接ＥＬＩＳＡ法检测经ＩＢＤＶ强毒攻击鸡的各脏器含毒情况，同时与ＡＧＰ法进行比较。结果表明两种方法具有良好的平行关系，间接ＥＬＩＳＡ法比ＡＧＰ法更为敏感；攻毒鸡的法氏囊带毒最多，而在脾、胸腺、肾中均未检出病毒抗原     

鸡传染性法氏囊病的快速诊断

应用鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体（ＦＭ＿１４）及其荧光标记物（ＦＭ＿１４－ＦＩＴＣ），对接种ＩＢＤ疫苗、强毒感染和自然病例鸡组织进行直接荧光抗体试验（ＤＦＡ）、斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳ－Ａ）和琼脂扩散试验（ＡＧＰ）三种检测方法的比较。结果表明，鸡接种疫苗后１０天内ＤＦＡ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ均呈阳性反应，而ＡＧＰ只在接种后６～８天的样品中检出抗原。２２例人工感染鸡和４０例自然发病鸡组织的检测结果表明，ＤＦＡ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的敏感性基本一致，且高于ＡＧＰ，它们的整鸡阳性率分别为９６．８％、９５．２％和３８．７％；所有的ＡＧＰ阳性标本Ｄｏｔ－ＥＬＩ－ＳＡ和ＤＦＡ均为阳性，后两种方法的符合率为８７％。９６批次（被检鸡群达３８７００头份）野外送检病例之脾、肺、肾和法氏囊组织切片ＤＦＡ阳性率分别为４０％，１１％、１０％和８８％，而总阳性率则为９５％。     

珍珠鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离及其VP2基因的分子遗传特征

为了确诊某动物园珍禽的疑似传染性法氏囊病(IBD)疫情,通过RT-PCR和病毒分离的方法对采集的病料进行鉴定,并对病毒的VP2基因进行分子和遗传分析。结果显示,分离到了1株传染性法氏囊病病毒(IBDV),其VP2基因与荷兰株D6948的亲缘关系最近,达到98.8%,同属于超强毒株分支;VP2蛋白关键氨基酸位点及七肽基序均符合超强毒的分子特征,从分子水平上证实此次珍禽疫情是由超强IBDV感染导致的;同时本试验首次发现IBDV导致白鹇和孔雀的发病死亡,说明IBDV的感染谱正在不断拓宽。结果表明,加强野生禽类IBD的分子流行病学研究,对IBD的防控具有重要意义。     

三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的"三联体"基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDVVP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDVVP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku。     

武汉地区群养鸡传染性法氏囊病的调查

对武汉地区5个养鸡场1990年3月至1990年9月份鸡传染性法氏囊病(IBD)发病情况进行调查,共调查7～60日龄易感鸡21800羽,发病10900羽,发病率为50％;死亡3300羽,发病死亡率为30.28 ％。各鸡场IBD的流行特点各有不同。通过病原分离,获得4株IBDV地方株,其中2株来自免疫IBD的鸡群,证明本省有IBDV强毒流行。用分离的IBDV1∶4囊毒液,接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜(0.2ml/胚),48小时可使48％～80％鸡胚死亡。     

用聚合酶链反应及核酸探针从新城疫病鸡体内检出传染性法氏囊病病毒

用鸡传染性法氏党病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）标记的ｃＤＮＡ探针组织印迹杂交试验，从某鸡场爆发新城疫（ＮＤ）的病鸡脾及法氏囊组织中检测到了ＩＢＤＶ，证明该ＮＤ病鸡存在ＩＢＤＶ的亚临床鸡鸡感染。进而分析了该疫情的爆发原因，并对鸡传染性法氏囊病的亚临床型感染和免疫程序进行了研究。     

传染性法氏囊病病毒Ⅰ型变异株的分离鉴定及其多价弱毒苗免疫试验

先后在江苏、浙江、四川等８省（区）从临床患传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料，分离到３２个野毒株，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，其中１７株病毒为传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），应用交叉中和试验，将分离毒株分为５个亚型，用ＩＢＤＶⅠ型标准变异株高免血清作中和试验鉴定，其中５个分离毒株有较高中和价，初步定为ＩＢＤＶⅠ型变异株。将其在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上连续传代致弱，与标准Ⅰ型弱毒株联合制成多价弱毒疫苗，免疫试验表明多价弱毒疫苗具有良好的免疫效果，免疫组攻毒１００％保护，对照组攻毒死亡率为９２％     

胶乳凝集试验在鸡传染性法氏囊病诊断中的应用

应用鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体（ＩＢＤＶ－ＭｃＡｂ）致敏的聚苯乙稀胶乳，建立了检测ＩＢＤＶ抗原和抗体的胶乳凝集（ＬＰＡ）和胶乳凝集抑制（ＬＰＡＩ）试验。ＬＰＡ可检测出６ｍｇ／Ｌ的ＩＢＤＶ蛋白。比较了ＬＰＡ、直接萤光抗体试验（ＤＦＡ）和琼脂扩散沉淀试验（ＡＧＰ）三种方法检测ＩＢＤＶ抗原的特异性、敏感性和相关性，明确了ＬＰＡ和ＤＦＡ的检出率高于ＡＧＰ，ＬＰＡ和ＤＦＡ检测结果的符合率为８６％。     

山西省鸡传染性法氏囊病流行病学调查

从１９８６年开始，先后对全省９个地市、２０个市县的６０多个鸡场和１４３６个专业户进行了鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的流行病学调查。疫区点存栏数７８９９３６只，发病５９９６７５只，发病率７５％；死亡２５１９９８只，死亡率４０％。由于近年来普遍应用疫苗和卵黄抗体防治，效果显著。１９９４年对１７个鸡场抽查结果，平均发病率控制在７％以下，减少发病６８％；死亡率降至３％，减少死亡３９％。     

引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

将从安徽省传染性腔上囊病(IBD)免疫失败的病鸡腔上囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了原核表达质粒pGEX-VP2,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,结果呈阳性反应;SDS-PAGE分析结果显示,重组VP2融合蛋白的分子质量为68ku,表达量约占菌体总蛋白量的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内;Western-blotting结果显示,重组VP2蛋白与IBDV抗体发生反应,形成一条特异性蛋白带,表明获得的重组蛋白具有良好的抗原反应性。