我国三省区细粒棘球绦虫基因的变异分析

对从青海省、甘肃省和新疆维吾尔族自治区采集的 2 4株细粒棘球蚴 ,用线粒体DNA的CO1基因和ND1基因结合rDNA的ITS2测序 ,调查了不同地区分离株基因型的变异情况。结果显示 ,所有分离株均为普通羊株 (G1基因型 ) ;CO1基因序列的变异率为 0～ 0 .8% ,ND1基因的变异率为 0 .1%～ 0 .7% ;青海分离株ITS2序列的变异率为 0 .4 %～ 3.1% ;2株青海省西宁市和 1株甘肃省武威市分离株分别在CO1基因和ND1基因序列不同位点发生的 1处核苷酸非同义替换 ,导致 1个编码的氨基酸替代。研究表明 ,我国上述 3省、区部分区域存在的细粒棘球蚴属于同一株 (G1基因型 )。     

基于线粒体nad1和nad4基因对四川省多头带绦虫种群遗传多样性的分析

为探讨多头带绦虫的种群遗传多样性,应用PCR方法扩增20株分离自四川省攀枝花市、雅安市、成都市的山羊脑部和肌间的多头蚴的线粒体nad1基因和nad4基因的部分序列,并进行分析。序列分析结果显示,20株多头蚴的pnad1基因和pnad4基因序列分别有2个和8个变异位点,长度分别为753bp和801bp,变异率分别为0~0.3%和0~0.8%,检测出3个和6个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.574±0.055和0.742±0.074,核苷酸多样性分别为0.000 82±0.000 53和0.002 88±0.001,平均遗传距离分别为0.002和0.003。构建的种系发育树显示,四川分离株与已知多头带绦虫位于同一分支,且与分布的地理区域、寄生部位没有直接的相关性。结果表明,四川多头带绦虫的遗传多样性水平低,其中nad1基因的遗传多样性水平低于nad4基因的遗传多样性。     

细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫(Eg)原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA.根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列.PCR产物经纯化后连接到pMDl8-T载体,转化至大肠杆菌DH5a后,进行序列测定和生物信息学分析.结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582 bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99%,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala82变为Val82.EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys48和Cys169,以及周围保守的FVCP和VCPA序列.EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69 bp的内含子.     

绵羊棘球蚴病的病原学鉴定及组织病理学观察

从疑似棘球蚴病病羊的肝以及肺分离包囊,抽取囊液,离心取沉淀,分离基因组DNA,用PCR方法扩增NADH脱氢酶亚基1(ND1)基因并测序,对棘球蚴感染羊进行了病原学鉴定,并对患病羊的肝和肺病灶进行了病理学分析,以确定病原体的性质及所致的组织病理学变化。BLAST分析结果显示,所获ND1序列与细粒棘球绦虫(G1基因型)ND1序列的相似性达99.9%,判定该病例由G1型细粒棘球蚴引起。取包囊及其周围肝、肺组织进行石蜡切片、HE染色,观察结果显示,细粒棘球蚴包囊的形成对肝和肺造成的损伤是多方面的,除有压迫性组织萎缩,结缔组织及胆管大量增生造成的肝硬变外,尚见肝急性变性、过敏性炎症反应等。肺除压迫性萎陷外,还有间质增生炎症、囊液外渗引起的过敏反应等。本研究表明,采用PCR方法可以准确确定该病的病原性质,结合病理学观察分析,可揭示羊细粒棘球蚴病引起的组织病理学变化及器官损伤的机制。     

4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1和nad1基因的序列分析

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫,以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA,用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因(cox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因(nad1)并进行测序,应用Chromas和DNAStar软件分析扩增产物的变异情况.结果表明,大庆地区4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1基因均为1 125 bp,nad1基因均为518 bp;且其线粒体基因存在差异,cox1的同源性为99.0%～99.7%,nad1的同源性为98.3%～99.4%.     

湖南省华支睾吸虫线粒体cox1和nad1基因的克隆及进化分析

为了研究湖南省华支睾吸虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅰ基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建华支睾吸虫与其他吸虫的种群遗传进化树。应用聚合酶链反应扩增华支睾吸虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序中的MP法和MEGA4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pcox1和pnad1序列长度分别为1 100bp和790bp,种系发育进化表分析表明,25个华支睾吸虫分离株位于同一分枝。证实华支睾吸虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为华支睾吸虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。     

青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析

从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA ,用EG95特异性引物进行PCR扩增 ,并克隆至 pGEM TEasy载体上 ,经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后 ,用DNAstar软件对 3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明 ,EG95基因的 3个序列 (EG95 QH 1、EG95 QH 2和EG95 QH 3)的片段大小为 14 35～ 14 37bp ,与GenBank中的EG95基因同源性为 73.2 %～99.2 % ,差异集中在内含子区域。其中EG95 QH 1、EG95 QH 3与GenBankEG95XJ ag、EG95 4序列的同源性较高 ;EG95 QH 2与GenBank中EG95 1、EG95 2、EG95 3序列的同源性较高。研究结果表明 ,青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的 3个序列为EG95基因家族的成员。     

猪流感病毒分离株HA基因的克隆与序列分析

从1株H3N2亚型猪流感病毒(SIV)中提取RNA,用RT-PCR方法扩增了其HA基因的全长cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果,扩增的H3N2亚型SIV HA基因长度为1 701个核苷酸,共编码566个氨基酸。核苷酸序列与已发表的中国香港、中国大陆、美国及欧洲分离的H3亚型毒株相近,核苷酸和氨基酸序列相似性均在97%以上,同属H3亚型。其HA1、HA2之间切割位点序列为PSIQSR↓G,从分子水平推论,属于非高致病力毒株。其推导的氨基酸序列中有8个糖基化位点,7个位于HA1基因的第8、22、38、63、126、165、285位点,1个位于HA2基因的154位点。研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF569597。研究结果为我国流感病毒基因库的建立、流感疫情的监测和防制提供了理论依据和技术资料储备。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析.结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%.中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近.表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫.     

口蹄疫病毒受体牛源β1亚基基因的分子特征

从口蹄疫病毒试验感染康复牛肺组织中克隆了β1亚基基因,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行了比较分析。结果显示,牛β1亚基基因的编码区含有2 397个核苷酸,编码798个氨基酸,含有10个潜在的糖基化位点,其中信号肽由20个氨基酸组成,胞外域由708个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞浆域由41个氨基酸组成。与GenBank中的牛β1基因的同源性达99.5%,从起始密码子开始共有12个碱基发生了变化,引起第217、247、268、281、321、691、709位的氨基酸改变,分别由F、S、W、V、H、Y、V变为S、P、R、G、Y、C、G。牛β1基因与猪、猩猩、猫、犬、人、小鼠和鸡的β1基因核苷酸序列同源性分别为93.8%、89.3%、91.6%、90.2%、89.6%、85.4%、75.6%,推导氨基酸序列同源性分别为98.2%、93.7%、97.5%、96.7%、94.2%、93.2%、84.1%。牛与猪β1亚基同源性最高。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2 对引物,对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定,其基因序列全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV 参考株的F 基因序列进行了比较。结果表明,核苷酸序列的同源性为82.6% ~98.1%,氨基酸的同源性为87.7%~98.7%。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(112R R Q K/R R F117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明,10 株NDV广西分离株中GX1/00、GX2/00、GX4/00、GX6/02、GX7/02、GX9/03、GX10/03和GX11/03为基因Ⅶd亚型,GX3/00和GX5/00为基因Ⅲ型。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

2004-2010年浙江省及其周边地区PRRSV GP5基因的分子进化与变异分析

用RT-PCR方法对分离自浙江省及其周边地区部分猪场的50个猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株和3个疫苗毒株的GP5基因进行了扩增、克隆和序列分析,并与国内外的代表性毒株进行了序列比对。结果表明,2004-2010年检测的PRRSV毒株均属于美洲型,大部分毒株属于亚群1,各毒株间的核苷酸和氨基酸同源性分别在81.6%～100%和72.1%～99.5%之间,浙江省及其周边地区亚群1毒株与我国最早分离到的美洲型毒株CH-1a的核苷酸和氨基酸同源性分别为84.5%～95.7%和78.6%～95.0%,与疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为88.1%～99.2%和85.4%～99.0%。糖基化位点以及抗原表位都有一定程度上的变异。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。