孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定

用人工合成的无色孔雀石绿-兔血清白蛋白(LMG-RSA)作抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术筛选抗无色孔雀石绿的单抗,单抗经纯化后对其特异性和灵敏性进行了鉴定,探讨了建立孔雀石绿的免疫学检测方法。结果显示,经细胞融合和筛选得到了1株分泌抗无色孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5E9。经鉴定,该杂交瘤细胞的染色体数为98.82±5.6,间接ELISA检测小鼠腹水的抗体效价达1.3×105,该细胞连续培养10代以上,生物学性状稳定,间接竞争ELISA(ciELISA)结果显示,无色孔雀石绿50%抑制的质量浓度为18.5μg/L,除孔雀石绿外,与其他类似结构和相关类型的药物没有交叉反应,表明该单抗用于孔雀石绿的检测有较大的应用价值。     

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

通过杂交瘤技术制备猪瘟病毒单克隆抗体,对酶联免疫吸附试验筛选的阳性单克隆抗体进行免疫组织化学研究,从中发现1株单克隆抗体能与感染猪瘟病毒的猪肾、肝病理组织切片及PK15细胞产生特异性染色反应,与非感染猪的肾、肝组织切片和PK15细胞无染色反应。单克隆抗体与猪瘟病毒感染的PK15细胞或猪肝、肾小血管内皮细胞中的猪瘟病毒呈现较强的特异性棕色着染,表明该单抗是针对猪瘟病毒的单克隆抗体,对研究猪瘟病毒在宿主细胞中的生命活动和繁殖定位有非常重要的意义。该单抗命名为YNF,培养上清液和腹水的抗体效价分别为1∶80和1∶10 000。抗体蛋白属IgG类,亚类为IgG2/κ。     

直接法单克隆抗体酶联免疫吸附试验和常规酶联免疫吸附试验诊断耕牛日本血吸虫病的比较

比较了直接法单克隆抗体酶联免疫吸附试验（ＭｃＡｂ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）和常规酶联免疫吸附试验诊断耕牛日本血吸虫病方面的差异，实验结果表明，直接法ＭｃＡｂ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对实验感染耕牛的阳性检出率为１００％（３２／３２），对安徽省自然感染耕牛（粪孵阳性）的阳性检出率为９３．９０％（４１８／４４５），对健康耕牛的阴性符合率为９８．５０％（６６／６７）；而常规ＥＬＩＳＡ对实验感染耕牛的阳性检出率为９５．３５％（４１／４３），对安徽省同一地区的自然感染耕牛的阳性检出率为９０．８２％（１８８／２０７），对健康耕牛的阴性符合率为８６．２７％（８８／１０２）。提示，直接法ＭｏＡｂ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ不仅具有操作简便、反应快速、成本低廉等优点，而且在阳性检出率和阴性符合率方面均优于常规ＥＬＩＳＡ。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

绵羊肺炎霉形体单克隆抗体的研制及初步应用

用绵羊肺炎霉形体（ＭＯ）抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，融合其脾细胞和ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞，筛选出６株分泌抗ＭＯ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系。用间接ＥＬＩＳＡ法对３株ＭｃＡｂ做特异性分析，该ＭｃＡｂ只特异地与ＭＯ抗原发生反应，而不与猪肺炎霉形体、山羊无乳症霉形体抗原发生反应。用检测ＭＯ抗体的间接ＥＬＩＳＡ与ＩＨＡ比较检测绵羊血清中抗ＭＯ抗体，前者的阳性检出率较后者高７．１４个百分点     

光滑型布鲁杆菌抗体竞争ELISA检测方法的建立

用提纯的布鲁杆菌疫苗株M5-90光滑型脂多糖(S-LPS)作为包被抗原,以针对S-LPS C表位的单抗16C5为竞争抗体,建立了检测光滑型布鲁杆菌血清抗体的cELISA方法.通过对临床507份牛血清样本进行检测,结果经统计分析表明,cELISA与RBT和IDEXX公司的iELISA试剂盒符合率分别为84.7%和91.2%.其中142份样品与Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的符合率分别为97.2%和94.4%.κ统计显示,该cELISA方法与RBT、IDEXX公司的iELISA试剂盒、Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的κ值均大于0.5,符合率很高.该cELISA方法为布鲁菌病的检测提供了一种有效的血清学方法,并且能够有效地排除常见的革兰阴性菌引起的假阳性结果.     

跗关节免疫法抗镉单克隆抗体的制备

为快速方便地检测环境水样中的镉离子浓度,以Cd-ITCBE-KLH为免疫抗原,采用小鼠跗关节注射抗原法,分2次免疫BALB/c小鼠,每次注射20μg抗原,首次免疫后第20天收获皮下腘淋巴结,采用常规方法与骨髓瘤细胞融合,筛选细胞株,以体内诱生腹水法收获单克隆抗体,纯化后建立了镉离子的竞争ELISA检测方法。结果显示,共筛选了A2G11、A4B8B1C2、B1G5、B4F12五株杂交瘤细胞,采用其中的1株A2G11细胞株建立了镉离子的竞争ELISA检测方法,其工作曲线方程为y=-0.119 5lg[Cd2+]+0.615 4,r2=0.973 2;半数抑制浓度为1.485μg/L,检测范围(IC20～IC80)为0.029～762.676μg/L,最低检测限为0.102μg/L;与其他金属离子的交叉反应≤3.684%。表明用该方法能够有效制备抗金属离子的单克隆抗体。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

应用间接酶联免疫吸附试验检测鸡传染性法氏囊病病毒

用制备的抗鸡ＩｇＧＭｃＡｂ－ＨＲＰ作为免疫试剂，以ＩＢＤＶ的高免阳性鸡血清作为抗体，用间接ＥＬＩＳＡ法检测经ＩＢＤＶ强毒攻击鸡的各脏器含毒情况，同时与ＡＧＰ法进行比较。结果表明两种方法具有良好的平行关系，间接ＥＬＩＳＡ法比ＡＧＰ法更为敏感；攻毒鸡的法氏囊带毒最多，而在脾、胸腺、肾中均未检出病毒抗原     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2蛋白免疫BALB/c小鼠3次后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合;融合细胞用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)检测;阳性细胞株经3次有限稀释法克隆后,获得7株分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3B4、3C9、3D7、3D10、4G11、4G7和5C6。7株杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水及其细胞培养液上清的ELISA效价分别是2.0×106、2.5×105、1.0×106、2.0×105、2.5×104、1.5×106、1.0×105和1.5×102、1.0×102、2.5×102、2.0×102、0.5×102、2.5×102、1.5×102。7株融合细胞的染色体数目为98~102条,与其他禽类病毒和MSB1、Sf9细胞无交叉反应,说明这7株单抗具有良好的特异性。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

乳牛L-选择素单克隆抗体的制备与亚类鉴定

以乳牛L-选择素为免疫抗原免疫BALB/c小鼠1只,相隔14 d进行3次免疫,抗原用量每次30μg,首次免疫后第116 d进行尾静脉加强免疫,抗原用量10μg。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后接种12块96孔板。以L-选择素包被酶标板,间接ELISA检测阳性孔,有限稀释法克隆阳性孔,筛选出6株杂交瘤细胞。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株制备McAb,并对其分别进行Ig亚类测定。结果,6株杂交瘤细胞7B10、10F6、10E2、5C6、12G7和11A3的Ig亚类分别是IgG2a、IgG2aI、gG2bI、gG1I、gG1和IgG1。