猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

猪细小病毒7型PCR检测方法的建立及应用

为评估猪细小病毒7型(porcine parvovirus 7,PPV7)在猪群中的流行,根据Gen Bank中PPV7全基因组序列设计1对扩增PPV7 NS1基因的特异性引物,并建立PCR方法。对该引物的退火温度进行优化,且分析其特异性和敏感性。结果显示,在52~72℃退火温度范围内该对引物均能特异性扩增出目的基因片段,最低检测限为3.6×10~2copies/L。对不同来源的282份组织样品和来自湖南省4个不同猪场的226份血清样品进行检测,结果,组织样品中PPV7检出率为55.0%(155/282),血清中PPV7检出率为10.2%(23/226)。其中,屠宰猪组织样品中PPV7检出率最高(71.4%),而PPV7感染对猪的健康是否存在影响还不能确定。本研究结果为PPV7流行病学的研究奠定了一定的基础。     

肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测肉食兽类细小病毒荧光定量PCR方法和探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间的相关性,在肉食兽类细小病毒VP2基因区分别设计了1对保守引物和1条TaqMan-MGB标记的水解探针,通过对貉细小病毒(RDPV)LN10-1株VP2基因上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增,构建标准重组质粒,由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线,建立了检测肉食兽类细小病毒基因组拷贝数的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在3.50×102～3.50×107 copies/μL范围内与Cp值呈良好的线性关系(R2可达0.999),最低检测浓度为35.0copies/μL。通过标准曲线得出RDPVLN10-1株样品的目标片段拷贝数,将拷贝数值与TCID50值进行相关性分析;分析结果显示,基因组拷贝数值与病毒TCID50值之间存在极显著的正相关关系(P<0.01),血凝效价与病毒TCID50值存在显著的正相关关系(P<0.05)。结果表明,与用血凝效价测定病毒含量的方法相比,用本试验建立的荧光定量PCR技术测得的病毒拷贝数值更能准确地代表活病毒的含量。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立

为建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒(CPV)的TaqMan荧光定量PCR方法,通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测。结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增。该方法检测的灵敏度达101copies/L,该方法的批内变异系数为0.09%~1.30%,批间变异系数为0.57%~0.94%,重复性良好。核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR的最低检测浓度均可以达到101 copies/L,且原液荧光定量PCR的产物浓度约为核酸荧光定量PCR的7倍,提示核酸在提取过程中有大量的损耗。对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板的阳性符合率均为100%,核酸法与原液法的符合率为100%。因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

猪星状病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立特异、灵敏及快速的猪星状病毒3型(PAstV3)检测方法并应用于临床检测,根据GenBank登录的PAstV 3序列,在ORF1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针;经过反应体系和反应条件优化,对建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行敏感性、特异性测定,并初步应用于临床粪便样品的检测。结果显示,该方法标准曲线线性关系良好,R2值达到0.997 1;与多种常见的猪病病毒均无交叉反应,特异性良好。与常规PCR相比,该检测方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高,批内、批间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性良好。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测,阳性率为40%,检出率高于常规PCR方法。上述结果表明,该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。     

猪圆环病毒2型及猪细小病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10²copies/μL和1.0×10¹copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性...     

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_t值与标准模板浓度在10^8.5～10^3.5PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.994 9,直线方程为y=-3.594 9x+41.006,最低检测限为10^2.50PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用

猪圆环病毒3型(PCV3)是近两年报道的一种新病毒,为实现快速检测PCV3的目的,笔者以我国PCV3全基因组为模板设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。经过标准曲线分析、敏感性、特异性和重复性等一系列试验,表明该方法具有特异性强、敏感性高以及重复性好的特点。试验结果表明,阳性PCV3标准品DNA稀释10-8后(浓度为50 copies/L)仍然可以被检出,不同浓度的组间和组内重复性试验结果显示变异系数均小于3%,最后用36份临床样品进行了应用性评价,结果从中检测出9份阳性样品,表明所建立的方法是一种高效的可用于PCV3的分子诊断技术。     

猪塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据猪塞尼卡病毒(SVA)VP1基因保守序列设计引物,通过优化反应条件,建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性的评价。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度达10 copies/uL,变异系数均小于2.0%,操作简单,耗时短。利用建立的检测方法对124份临床样本进行检测,结果,阳性率为3.2%。上述结果表明,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法可用于猪原发性水泡病临床样品的快速检测和流行病学调查,具有良好的应用前景。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16 S rRNA基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为88.5℃,最低能检测到含0.036 fg/μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。