蓝狐源嗜酸乳杆菌ZJBF003株的分离鉴定及其体外益生潜能的评价

为获得动物源乳酸菌并对其益生潜能进行评价,对蓝狐源乳酸菌进行了分离鉴定并通过测定其生长曲线、产酸能力、对低p H和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性、对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力、抗氧化性及安全性评价了菌株的益生特性。将从蓝狐的肠道内容物中分离到的1株优势乳酸菌命名为ZJBF003,经菌落菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析将其鉴定为嗜酸乳杆菌。该菌株的产酸能力较强且在37℃培养时能迅速进入对数生长期;在pH为5的MRS培养基中耐受6 h时仍能保持较好的生长情况,在胆盐质量浓度为3 g/L的条件下至少可耐受6 h,且存活率接近70%,在人工模拟胃液和肠液中耐受3 h时存活率高于95%;对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果;对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力为(39.03±6.57)CFU/cell;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为24.80%,表明菌株ZJBF003具有一定的抗氧化活性;小鼠安全性试验结果表明,无毒副作用。这些特性表明,新分离的蓝狐源嗜酸乳杆菌ZJBF003株具有优良的体外益生性能,可作为潜在益生菌制剂材料进一步研究。     

猪源生物被膜乳酸菌的筛选与体外益生特性评价

为了研制优良的猪用微生态制剂,从健康猪的新鲜粪便中成功分离获得1株抑菌效果较好、生物被膜形成能力较强的L-11乳酸菌,经16S rDNA分子生物学鉴定,确定该分离株为约氏乳杆菌。并进一步对其体外益生特性包括产酸能力,耐酸碱、耐胰蛋白酶、耐高温、生长曲线、抑菌性能、黏附性以及对小鼠的致病性进行了检测。结果表明,该菌株具有一定的产酸能力,对pH4.0～10.0、10 g/L胰蛋白酶、50和60℃高温环境具有耐受能力;并在MRS液体培养基中培养大约4 h后进入对数生长期,12 h后达到稳定期;此外,该乳酸菌分离株具有广泛的抑菌谱和一定的黏附性,安全、无毒性。这说明乳酸菌L-11分离株可作为猪用益生菌研制的菌株。     

罗伊氏乳杆菌ZL2a株体外益生潜能的评价

为了评价新分离猪源罗伊氏乳杆菌ZL2a株的益生潜能,通过测定其生长曲线、产酸能力、对低pH和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性及对Caco-2细胞的黏附能力评价了该菌株的益生特性。结果表明,菌株ZL2a产酸能力较强且能迅速进入对数生长期;在pH为2.5的MRS培养基中耐受4 h时活菌数目基本不变,在胆盐浓度为3 g/L的条件下至少可耐受4 h,在人工模拟胃液和肠液中耐受8 h时存活率高于70%;对大肠杆菌、溶血性葡萄球菌、普通变形杆菌等致病菌具有广谱的抑菌效果;对Caco-2细胞的黏附能力为621±30.4 CFU/30 cells。这些特性表明,新分离的罗伊氏乳杆菌ZL2a株具有优良的体外益生性能,可作为潜在饲用益生菌进一步研究。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

发情期大熊猫阴道源产H_2O_2乳酸菌的分离鉴定及筛选

为了筛选大熊猫阴道中具有产过氧化氢特征的阴道乳酸菌,通过菌落形态特征、生化特性及触酶反应等对10只发情期大熊猫阴道乳酸菌进行分离鉴定,获得42株乳酸菌,经产过氧化氢半定量试验筛选出18株产H_2O_2的乳酸菌。将18株乳酸菌通过16S r DNA测序并进行NCBI Blast分析,鉴定出粪肠球菌(Enterococcus faecalis)12株、泰国肠球菌(Enterococcus thailandicus)2株、屎肠球菌(Enterococcus faecium)1株、耐久肠球菌(Enterococcus durans)1株、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)1株、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)1株。用Neighbor-Joining Tree方法构建的系统进化树表明,这18株乳酸菌的16S r DNA以100%的相似性聚在同一个分支上。上述结果为进一步研究大熊猫阴道益生菌奠定了基础。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16S rDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌。体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用。pH及胆盐耐受性试验结果表明,WLS001耐受性最强,在pH为2.0、胆盐浓度0.2%条件下均能生存。药敏结果显示,4株菌均对万古霉素耐药。安全性试验表明,所有唾液乳杆菌均没有溶血环,试验组雏鸡体重较对照组增重显著(P0.05)。组织病理切片显示,脾、肝、盲肠及十二指肠形态均正常。结果表明,4株鸡源唾液乳杆菌具有良好的生物学特性和安全性,具备进一步开发微生态制剂的潜力。     

表达传染性腔上囊病病毒VP2蛋白重组乳酸菌的构建及其免疫保护效果

为探讨表达传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白重组乳酸菌的口服免疫效果,采用RT-PCR方法扩增了1株IBDV流行毒株的VP2基因,再分别亚克隆到干酪乳杆菌和乳酸乳球菌的表达载体pPG2和PNZ8112中,并分别电转化干酪乳杆菌L.casei393和乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞,构建了重组菌pPG2-VP2/L. casei393和PNZ8112-VP2/NZ9000.分别经20 g/L乳糖和1 ng/mL的乳链菌肽诱导表达后,对菌体裂解物进行了SDS-PAGE和Western-blot分析.结果显示,重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000的裂解物中分别出现大小约为53 ku和50 ku的反应带,大小均与预期结果相符,表明目的蛋白在重组菌中得到了表达.重组菌pPG2-VP2/L. casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000分别口服免疫SPF雏鸡后,均刺激机体产生了特异性抗IBDV VP2蛋白的血清抗体;攻毒保护试验结果显示,其保护指数分别为62.5%和37.5%,表明重组菌免疫雏鸡后,对IBDV的攻击均具有不同程度的免疫保护作用.     

土霉素降解菌的筛选及其降解特性研究

为了获得对土霉素具有降解活性的细菌,在建立无机盐培养基中土霉素含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法的基础上,从某土霉素生产厂污水池底泥中分离能够高效降解土霉素的菌株,建立了土霉素高效降解菌的筛选模型,并进行了降解菌株降解特性的研究。结果表明,分离到的1株能高效降解土霉素的菌株(Oxy2),经初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。该菌株最高可降解200 mg/L土霉素,对土霉素降解的最适条件为温度35℃,pH 7.0,土霉素浓度50 mg/L,装液量80 mL。此外,添加不同的碳源或氮源均有利于细菌对土霉素的降解,其中加入5 g/L可溶性淀粉或酵母浸液影响更显著。金属离子对菌株降解土霉素的速率亦有影响,其中添加1 g/L的Fe3+和Zn2+时可提高Oxy2菌株对土霉素的降解率,而Co3+,Pb2+,Cr3+可明显抑制细菌对土霉素的降解率。     

藏猪源益生芽胞杆菌的筛选鉴定及部分益生特性的研究

从藏猪粪便中分离筛选出具有良好益生潜力的益生芽胞杆菌,为藏猪源益生菌的开发奠定基础。先将健康藏猪粪便滤液于90℃水浴处理10 m in以杀死样品中的非芽胞杆菌,涂布于培养基后挑取单菌落纯化并扩大培养,再进行拮抗试验筛选能抑制常见病原菌的芽孢杆菌。综合形态学、生理生化特征及16S r D N A序列分析对筛选菌株进行鉴定,通过菌株耐受性试验、产水解酶试验、抗生素敏感试验等对菌株生物学特性进行研究。结果显示,筛选到3株对常见病原菌具有一定抑制作用的芽胞杆菌,其中,解淀粉芽胞杆菌SW U N-TP23在不利环境中具有较强的稳定性,可代谢产生纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶,菌体内不含抗常用兽用抗生素的耐药基因。结果表明,分离筛选到的解淀粉芽胞杆菌SWUN-TP23有良好的潜在益生能力,具有进一步开发研究的价值。     

水貂A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及免疫原性研究

从送检的疑似多杀性巴氏杆菌感染的水貂中分离到1株病原菌,经培养特性、形态观察、生化试验、PCR鉴定等,确定RC1108菌株为血清A型多杀性巴氏杆菌。水貂回归试验表明,该菌株毒力较强,最小致死剂量为2.5×10~8CFU。制备的灭活疫苗在含菌量为1.5×10~9 CFU/m L时,即可在免疫后第21天提供保护。表明,该分离菌株可以作为水貂血清A型多杀性巴氏杆菌疫苗的候选株。     

解淀粉芽胞杆菌固态发酵黄芪培养基的研究

为筛选优化解淀粉芽胞杆菌固态发酵黄芪培养基,用于生产发酵黄芪制品,以黄芪黄酮质量分数为指标,采用单因素试验对菌株适宜发酵培养基成分进行筛选;采用二次正交旋转组合试验设计及响应面法,优化黄芪固态发酵培养基。结果显示,在筛选成分中最适发酵培养基成分为黄芪、黄豆粉和碳酸钙。用其分别替代基础培养基中的相应营养物质,然后接种解淀粉芽胞杆菌,置37℃以150 r/min振荡培养24 h,其固态发酵物中黄芪黄酮质量分数分别为2.84、2.78和2.75 mg/g。优化的固态发酵培养基为:黄芪粉300 g/L、黄豆粉100 g/L、碳酸钙2 g/L、水598 m L/L,37℃发酵培养24 h,固态发酵物中的黄芪黄酮质量分数达3.21mg/g。结果表明,优化的黄芪固态发酵培养基适宜解淀粉芽胞杆菌生长,易于黄芪黄酮释放,筛选培养基原材料符合固态发酵产业化生产条件。     

表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性研究

为构建表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌,本试验按照乳酸乳球菌表达的偏好性,优化合成副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的编码碱基序列,将其接入表达载体pNZ8149的多克隆位点并导入食品级乳酸乳球菌NZ3900。将重组乳酸乳球菌灭活后经肌肉注射免疫SPF鸡,免疫后攻毒测定乳酸乳球菌的保护效果,检测血清中Ig G抗体和鼻黏膜sIgA抗体水平并检验免疫效果。PCR结果显示,成功构建了含p9片段的重组乳酸乳球菌,Western-blot检测显示,p9片段可在重组乳酸乳球菌内表达。重组菌最佳诱导表达条件:Nisin浓度为20 ng/m L、诱导时间为4 h。鸡肌肉注射免疫后可产生p9蛋白特异性的血清Ig G和鼻黏膜sIgA抗体。乳酸乳球菌重组疫苗免疫鸡对副鸡禽杆菌攻毒的保护率为60%~80%。结果表明,本研究成功构建了重组乳酸乳球菌pNZ8149-p9/NZ3900,该重组菌作为免疫原免疫鸡,对副鸡禽杆菌攻毒具有较好的免疫保护作用。     

八株芽孢杆菌的分离鉴定及其抗逆性比较

从土壤中分离到3个菌株,分别命名为KF、DY和LB1,从猪粪便中分离到5个菌株,分别命名为KH、K2X、KY1、LB2和LY3,通过16SrRNA基因序列分析,结合细菌形态学、生理生化特性进行了鉴定,并对分离菌的抗逆性进行了比较。经鉴定,KF、KH、K2X和KY1菌株为枯草芽孢杆菌,LB1、LB2和LY3菌株为蜡样芽孢杆菌,DY菌株为地衣芽孢杆菌;抗逆性比较结果显示,K2X菌株对温度比较敏感,其他菌株经60℃处理30min后不影响其生长;DY菌株耐酸性最强,能在pH3的胃液中正常生长;KY1菌株的耐酸性次之,耐胆盐能力最强,能在胆盐含量为6g/L的培养基和模拟肠液中正常生长。研究还发现,这8个菌株对共培养的大肠杆菌都没有抑制作用,只有KF、KH和LB2菌株对共培养的沙门氏菌分别有28.6%、27.0%和24.6%的抑菌效果。     

断奶仔猪胃肠道乳酸菌及芽孢杆菌的分离鉴定

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius);ZR株为直肠源的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);MR株为盲肠源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis);分离株WY、SY、KY分别为胃、十二指肠、空肠源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);HY株为回肠源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cere-us)。各分离株的生长曲线有明显差异,HR、ZR和WY株的生长速度较快,分别于接种后第12、12和20小时达到生长高峰期,显示了良好的培养特性。     

复方庆大霉素注射液的质量控制及体外抑菌效果

为制备复方庆大霉素注射液,对其进行质量控制方面的测定,同时进行注射液的体外抑菌试验,以便给临床应用提供理论依据。通过预实验和L9(33)正交设计优化制备处方。对复方庆大霉素注射液分别进行澄明度检查、p H值检查、热原检测试验等质量控制研究。通过对患乳房炎母猪的乳汁进行细菌分离培养和生化鉴定,采用二倍管稀释法测定复方庆大霉素注射液和庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MIC和MBC。结果,复方庆大霉素注射液的最优配方为:每50 m L注射液中硫酸庆大霉素为1 g,氟尼辛葡甲胺为0.01 g,助溶剂N,N-二甲基甲酰胺为6%,稳定剂聚乙二醇为3%,抗氧化剂无水亚硫酸钠为0.06%。质量控制结果显示,注射液澄明度检查未检出可见异物,p H在7.0~7.5,无热原出现。从患猪奶样中分离出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。体外抑菌试验结果表明,复方庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的MIC分别是1.18、2.35、4.70 g/m L;庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MIC分别是2.35、4.70、9.39 g/m L。复方庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MBC分别是2.35、9.39、9.39 g/m L;庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MBC分别是4.70、18.78、18.78 g/m L。结论:确定了复方庆大霉素注射液配方,质量控制符合注射液要求,对常见的病原菌具有良好的抑菌效果。     

隐性乳腺炎乳牛乳样中苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

自 2 0 0 2年 10月起 ,笔者从西安及其周边地区乳牛中随机抽取 4 8头共 184个乳室 ,进行了乳牛隐性乳腺炎的调查及病原菌分离鉴定。共分离出 3株革兰氏阳性芽孢杆菌 ,初步鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。该菌的培养特性及形态与蜡样芽孢杆菌极为相似 ;小白鼠腹腔注射可致其死亡 ,证明该菌所产毒素毒力较强。1　材料与方法1.1　乳样采集　先用温水洗涤乳牛乳房 ,继用 2mL/L新洁尔灭洗涤 ,再用 75 0mL/L的酒精消毒乳头。每个乳头弃去头 2～ 3把奶 ,然后每个乳室收集乳样 5～ 10mL ,标明牛号、乳区及日期待检。1.2　乳腺炎的…     

乳酸菌对子宫内膜上皮细胞的黏附及其对致病菌的拮抗作用

以永生化山羊子宫内膜上皮细胞作为体外模型,采用革兰氏染色法观察乳酸菌和致病菌对子宫内膜上皮细胞的黏附特性;通过平板计数法观察乳酸菌对致病菌的黏附拮抗作用.结果显示,嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、盲肠肠球菌对子宫内膜上皮细胞均表现出很强的黏附特性,黏附细菌数分别为每个细胞87、45、34个.黏附拮抗试验显示,3株乳酸菌均使致病菌...     

粤西地区两株鹅源鸭疫里氏杆菌的分离鉴定

从疑似患有鸭疫里氏杆菌病的病死雏鹅分离病原菌并对分离到的菌株进行了形态学观察、生化试验、血清型鉴定、PCR鉴定、药敏试验及16SrRNA基因序列分析。结果显示,2个分离菌株为Ⅰ型鸭疫里氏杆菌;它们均对22种常用抗生素表现出耐药。这2株鹅源分离株与鸭源鸭疫里氏杆菌处于同一进化支上,与同属rRNA总科Ⅴ的伯杰氏菌属、金黄杆菌属、黄杆菌属的进化关系较近,与大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌的进化关系较远。     

兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性

对从山东某獭兔养殖场病死仔兔肺中分离的1株疑为巴氏杆菌菌株进行了菌落形态学观察及培养特性、革兰氏染色、生化反应、仔兔致病性回归试验、小鼠毒力试验,并采用PCR方法对该分离株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰氏染色阴性,生化试验及PCR鉴定结果显示为F型多杀性巴氏杆菌,能引起獭兔仔兔肺出血、坏死,并致部分仔兔死亡。表明该分离菌株为比较少见的兔F型多杀性巴氏杆菌。     

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。