鼠伤寒沙门菌双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗候选株,在单缺失株SL1344Δcrp的基础上,运用自杀性质粒介导的细菌同源重组技术敲除sipB基因,构建了双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB。PCR及测序结果表明SL1344ΔcrpΔsipB构建成功。生物学特性研究表明,SL1344ΔcrpΔsipB血清型未发生变化,遗传性稳定。与亲本株SL1344相比,双缺失株的生长速度明显减慢,毒力降低了约99.9%以上。免疫保护效力试验显示,6周龄昆明小鼠口服免疫SL1344ΔcrpΔsipB后第17天,利用鼠伤寒沙门菌野生株攻毒,保护率为60%;免疫后第21天血清抗体效价达到峰值。上述结果为进一步研制安全有效的鼠伤寒沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其基本生物学特性的测定

为构建能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌,以pMD19-T-Apoptin为模板,PCR扩增出TAT-Apoptin融合基因,将其连接至pYA3493,构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin;然后将其电转至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd,并对该重组减毒沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。PCR和测序结果表明,成功构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin。进一步对重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)研究发现,其生长速度比强毒株SL1344明显减慢,与缺失株SL1344ΔcrpΔasd及互补菌株SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493)基本一致,且能够稳定遗传TAT-Apoptin融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到TAT-Apoptin蛋白条带。以上结果证明,能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)构建成功,且该重组菌能分泌性表达TAT-Apoptin蛋白。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

携带Apoptin的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统的构建

为研究减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin的特性,将Apoptin基因克隆入载体pYA3493-SopE,构建重组载体pYA3493-SopE-Apoptin,然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,对该重组菌生长特性、生化特性、毒力和表达等特性进行分析;同时将重组菌体外感染B16F10黑色素瘤细胞,分析其介导Apoptin对B16F10的作用。PCR、酶切检测表明,携带Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE-Apoptin)构建成功;生物学特性分析发现,重组菌的生长特性、生化特性与缺失株ΔcrpΔasd SL1344和互补株ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE)相近,与亲本株SL1344差异明显;腹腔感染重组菌的C57BL/6小鼠的LD_(50)为1.69×10~7CFU;在重组菌培养上清和感染的B16F10细胞内均可检测到SopE-Apoptin蛋白条带。进一步研究其介导Apoptin对B16F10细胞的作用发现,重组菌可抑制该细胞增殖,且具有MOI浓度梯度和感染时间依赖性;用TUNEL法可观察到TUNEL阳性细胞;Western-blot可在重组菌感染的细胞内检测到Caspase-9凋亡信号蛋白表达。以上结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够介导Apoptin蛋白的分泌性表达,且能够诱导肿瘤细胞B16F10的凋亡。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。     

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。     

不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因鉴定

为鉴定鸡白痢沙门菌生物被膜形成不依赖Rpo S的调控基因,以鸡白痢沙门菌S6702及其rpoS基因缺失株S6702ΔrpoS为母本,对S6702生物被膜状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7BF vs S7SBF）及S6702ΔrpoS浮游状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7SFY vs S7SBF）进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,构建基因缺失株并验证其生物被膜形成能力。结果显示,S7BF vs S7SBF组共鉴定出83个差异表达基因,S7SFY vs S7SBF组共鉴定出1 984个差异表达基因,筛选出15个可能与生物被膜形成相关的基因。以STM2361和STM1703为靶标构建基因缺失株,结晶紫染色定量结果显示,STM2361不影响鸡白痢沙门菌生物被膜的形成,而STM1703缺失能增强鸡白痢沙门菌的生物被膜形成能力。本研究鉴定出不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成调控基因,丰富了鸡白痢沙门菌生物被膜调控的信息。     

密度感应系统luxS基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性及毒力的影响

通过构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,研究其生物学特性及对Ⅵ型分泌系统(T6SS)的影响。利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,比较野生株、luxS缺失株的生长特性、运动性、生物被膜、致病性等生物学特性的差异。利用荧光定量PCR、Western-blot对luxS基因缺失株T6SShcp1、hcp2和clpV基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示,LuxS对鼠伤寒沙门菌生长速度、生物被膜形成能力及细胞黏附侵袭能力均无明显影响,但导致其运动性显著增强、致病力下降3.2倍,且不能合成自诱导分子2。在对数生长期和平台期,luxS基因均不影响T6SS核心组分Hcp1、Hcp2和ClpV的转录和表达。本研究表明,luxS基因缺失导致鼠伤寒沙门菌运动能力增强及毒力降低,但其不能影响T6SS核心组分的转录及表达。     

鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了探讨yibT基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,采用λ-red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌CVCC541的yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT,同时利用表达质粒pET28a构建yibT缺失株的基因回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,研究野生株、缺失株、回补株之间的生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物膜形成和应激环境抵抗力等生物学特性。结果表明,本研究成功构建了yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT及其回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,yibT基因的缺失不影响细菌的生化特性,该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其生长特性较野生株及其回补株显著减缓,生物膜形成能力相较于野生株及其回补株有所减弱,缺失株在热应激环境以及正丁醇压力下表现出更强的耐受力。综上所述,yibT基因的缺失会影响鼠伤寒沙门菌的生长特性、生物膜形成、应激环境抵抗力和细菌形态等生物学特性,并且yibT基因可能影响鼠伤寒沙门菌菌膜的流动性。     

松鼠猴源沙门菌的分离鉴定及生物学特性研究

从扬州某动物园病死松鼠猴的病料中分离出疑似沙门菌株,经革兰氏染色镜检、生化试验、PCR扩增沙门菌invA基因和血清型鉴定,再对该菌株的生物学特点如致病性、生物被膜形成能力和药物敏感性进行研究。结果表明,从送检猴肝中分离出的菌株,革兰氏染色为阴性短杆菌;能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等,不能发酵乳糖和蔗糖,V-P反应阴性,MR阳性;PCR检测inv A基因为阳性,确认分离菌为沙门菌;血清型鉴定为鼠伤寒沙门菌。致病性试验采用灌胃方式攻毒小鼠,18 h后小鼠死亡。生物被膜检测结果表明,该分离菌株有较强的生物被膜形成能力。药敏结果显示,分离菌对头孢噻肟、头孢哌酮和卡那霉素等敏感,对庆大霉素、链霉素和复方新诺明耐药。     

鼠伤寒沙门菌sipB基因对HeLa细胞糖酵解的影响

为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与HeLa细胞糖酵解的关系,将鼠伤寒沙门菌sipB基因缺失株、互补菌株及其野生型菌株分别感染HeLa细胞,并对细胞中丙酮酸、乳酸以及ATP含量进行检测。结果显示,与野生型菌株和互补菌株相比,sipB基因缺失株感染HeLa细胞,细胞中丙酮酸含量降低,乳酸、ATP含量升高,表明HeLa细胞糖酵解增强。本研究为分析sipB基因与HeLa细胞糖酵解的关系,进而为研究sipB基因的功能奠定基础。     

稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性

为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。     

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

沙门菌R-M系统hsdM基因对转座子转座效率的抑制效应

转座子是一种能够在转座酶作用下随机插入到宿主基因组中的DNA可移动元件,常被用作挖掘宿主功能基因的工具。细菌宿主限制性修饰系统(R-M)能够稳定基因组,抑制转座子插入基因组中。为了分析沙门菌R-M系统对外源转座子插入的抑制效应,本研究利用自杀质粒的方法构建SL1344的hsdM基因缺失株,制备其相应的Mini-Tn5和TnSC189转座子突变库,通过平板计数,计算并比较转座效率,分析hsdM基因对转座子转座效率的抑制效应。结果显示,Mini-Tn5和TnSC189转座子对S06004的转座效率均显著高于SL1344和C50041,TnSC189对三种血清型沙门菌转座效率均高于Mini-Tn5。而hsdM基因缺失显著提高了对SL1344的转座效率,表明hsdM基因表达对转座子基因组插入存在显著的抑制效应。本研究证实,沙门菌hsdM基因能够抑制外源转座子插入和维持基因组稳定性的功能,为hsdM基因稳定基因组的机制研究奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上，通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段，依次构建重组克隆载体pMD 18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225，随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌，与受体菌ΔLpp进行结合转移，构建双基因缺失株ΔLpp/LppB，通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示，成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB，其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明，协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后，双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著，这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能，为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

单增李斯特菌TatD基因缺失菌株的生物学特性研究

为探究TatD基因缺失对单增李斯特菌生物学特性的影响,本研究对缺失菌株LM10403sΔTatD的生化特性、生长特性、生物被膜、环境适应性、黏附、侵袭、增殖、耐药性、溶血特性和毒力等生物学特性进行研究。结果显示,LM10403sΔTatD与亲本菌株LM10403s的生化特性和生长特性均无明显差异。LM10403sΔTatD保留了LM10403s对温度、H₂O₂和EtOH的适应性,并且对巨噬细胞Raw264.7的黏附、侵袭和增殖没有发生明显改变。但与LM10403s相比,LM10403sΔTatD对高温(54℃)、酸性和苯扎溴铵的耐受性以及对头孢曲松的耐药性和胞外分泌蛋白的溶血特性均有所降低,而生物被膜形成能力有所提升。LM10403sΔTatD腹腔注射感染6周龄小鼠的LD₅₀为2.58×10⁶CFU,毒力稍低于LM10403s。上述结果表明,TatD基因缺失对单增李斯特菌LM10403s的生物学特性整体无明显影响,部分环境适应性和溶血特性有所降低,而生物被膜形成有所增加,为进一步探究TatD在单增李...     

鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建

为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。