以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的PRRSV病毒样颗粒疫苗的构建

为采用乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体,构建含美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5糖基化蛋白抗原表位的HBc-GP5病毒样颗粒(VLPs)疫苗,对HBc序列进行密码子优化,将其克隆至pET-28a(+)载体中,获得质粒pEO-NEW。在HBc刺突顶端的免疫显性区插入优化后的GP5序列,获得重组表达质粒pEO-LEORF5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG 22℃诱导表达。利用SDS-PAGE和Western-blot验证融合蛋白pEO-LEORF5的表达。超声破碎后利用蔗糖密度梯度离心对融合蛋白进行纯化,最后用透射电镜观察VLPs的形成情况。结果表明,重组表达质粒pEO-LEORF5构建正确。表达的融合蛋白的分子质量为32ku,以包涵体和可溶性两种形式表达。经浓缩纯化后融合蛋白纯度可达67%,且能自主装配为VLPs。本试验成功构建出新型HBc-GP5VLPs候选疫苗,为研发新型PRRS疫苗提供了新思路。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSV GP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR-Ub-optiGP5。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR-optiGP5和pIR-Ub-optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR-optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR-Ub-optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR-optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

缺失信号肽和跨膜区的PRRSV GP5融合蛋白基因的表达

通过分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株GP5基因序列,设计了2对引物,经PCR扩增,获得不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121 bp和248 bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将2段基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组表达质粒pET-GP5。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得高效表达。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白能与特异性血清抗体反应,表明表达的PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

猪CD8分子α链胞外区基因片段在毕赤酵母中的表达

为了给猪CD8α分子单克隆抗体的研制提供高生物学活性的抗原,采用PCR方法从pGEM-T-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α分子的胞外区基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pCD8α-ED,在毕赤酵母中进行表达,并对重组基因工程菌的发酵时间、pH值进行了优化。结果表明,表达出约20ku的目的蛋白,诱导表达的最适pH值为5.0,诱导表达的最佳时间是120h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被鼠抗人CD8α多克隆抗体识别,在20ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有免疫活性结构。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得了融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析。以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western-blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明:Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分,即58 ku和30ku,二者相加与预测大小88 ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

杆状病毒GP64蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为研究杆状病毒GP64蛋白在感染宿主过程中的表达情况,通过克隆构建含GP64基因的重组质粒,在CHO-S细胞表达重组GP64蛋白,利用野生型杆状病毒免疫BALB/c小鼠血清,筛选出重组GP64蛋白的单克隆抗体。结果表明,构建出正确的GP64重组质粒,成功表达出GP64蛋白,筛选出1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞5B1;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单抗亚类为Ig G2b,轻链类型为κappa;IFA和Western-blot结果显示筛选出的GP64单克隆抗体可以与杆状病毒及GP64蛋白发生特异性结合。结论,GP64蛋白的单克隆抗体制备成功。     

产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4～5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

牛浮舰蛋白-2在真核细胞中的表达与鉴定

采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源,采用融合PCR法构建突变体,分别利用标签抗体和针对浮舰蛋白-2的抗体鉴定突变体表达蛋白的特性。测序结果表明,成功构建了Flotillin-2基因的全长ORF及其突变体mFlotillin-2的重组质粒。Western-blot结果显示,Flotillin-2基因的全长ORF在CHO细胞中表达时除出现与预期大小相一致的48ku目的蛋白带外,还有1个35ku的条带。基因序列分析发现,在第430~438位核苷酸存在1个似Kozak序列(CGCATGGGC)。将ATG突变成GCT(丙氨酸)后,Western-blot结果显示,突变前后35ku的小蛋白始终存在。本研究以pcDNA3.1(-)/Myc-His(B)为载体,实现了牛Flotillin-2基因的全长ORF的真核表达,证明了35ku小蛋白并不是由于重新起始翻译导致的,而可能是浮舰蛋白-2在翻译过程中的裂解产物。     

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55 ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。     

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。     

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增,将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-nsp4,测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明,重组菌可表达分子质量约23 ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化,获得了高纯度的重组蛋白,Western-blot分析结果表明,nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。     

鹿结核病流行株融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的原核表达

以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,并采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化。基因测序结果显示,融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的序列与GenBank中序列的符合率为99.89%。SDS-PAGE分析显示,融合基因在大肠杆菌中成功被诱导表达,获得以可溶形式表达的融合蛋白,该蛋白的分子质量约为60ku。Western-blot鉴定结果显示,纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,说明该融合蛋白具有良好的反应原性,这一结果为它在鹿结核病血清学诊断中的应用奠定了试验基础。     

牛胸腺素原α基因的原核表达与分析鉴定

为了把牛胸腺素原α(ProTα)开发为免疫增强剂,从重组克隆载体pMD18-T-ProTα上扩增ProTα基因,分别构建和筛选出了pGEX-4T-1-ProTα、pET-30a(+)-ProTα的BL21、BL21codon plus和Rosetta Blue(DE3)plys重组原核表达菌株,采用不同的条件组合对其进行诱导表达。结果,重组菌BL21codon plus-pET-30a(+)-ProTα表达出约24ku和30ku两个蛋白条带,且在37℃、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导3h时表达量最大,重组蛋白主要以可溶性形式存在;而pGEX-4T-1-ProTα重组菌在诸多条件下都未表达出目的蛋白。纯化产物的Western-blot分析显示,重组蛋白可与兔抗人ProTα多抗发生特异性免疫反应,表明重组蛋白具有免疫学活性结构。研究结果为重组ProTα蛋白的结构与功能研究奠定了基础。