副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

沙门菌和副溶血性弧菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌invA基因和副溶血性弧菌toxR基因的保守序列设计引物和探针,通过优化反应条件与参数,建立了可同时检测沙门菌和副溶血性弧菌的双重荧光PCR方法.结果显示,该方法敏感度高,特异性强,重复性好.对沙门菌和副溶血性弧菌的检测低限均低于每反应体系10CFU,经对29株非目标菌进行检测均呈阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%;应用该方法检测人工染菌样品和实际样品,结果与SN标准方法的检测结果一致;应用该法可在8h内完成对样品中沙门菌和副溶血性弧菌的同步检验.     

免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究

应用兔抗副溶血弧菌IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线,山羊抗兔IgG包被对照线,胶体金标记兔抗副溶血弧菌IgG-1制成检测试纸条,建立了检测副溶血弧菌的免疫金层析试纸条法(IGCA)。结果显示,阳性者试纸条检测线和对照线均出现红色线,试验过程仅需5～15min即可判断结果,该法对副溶血弧菌的最低检测量为3.592×104 CFU/mL,与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌等常见肠道菌不发生交叉反应。将试纸条4℃存放6个月,常温存放3个月,37℃存放1个月,检测结果无差异。结果表明,建立的试纸条检测方法操作简便快速、灵敏度高、特异性强和稳定性好,非常适于基层养殖部门应用。     

副猪嗜血杆菌纳米PCR检测方法的建立

为了建立副猪嗜血杆菌(HPs)的高效纳米PCR检测技术,根据文献合成了1对针对HPs的16S rRNA基因的特异性引物,并对纳米PCR的反应条件进行优化。然后用建立的纳米PCR检测HPs、大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌及猪链球菌2型等猪源细菌以验证该纳米PCR的特异性,同时比较该纳米PCR与普通PCR的灵敏度。特异性试验结果表明,只有HPs能够扩增出822bp的目的片段,其他细菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,建立的纳米PCR的敏感性比普通PCR高10倍,最低可检出4.19×10-6 ng/μL的HPs基因组DNA。结果表明,本研究建立的基于16S rRNA基因的HPs纳米PCR具有较好的特异性和较高的灵敏度,是一种高效、快速的检测方法,可为副猪嗜血杆菌病的防控和检验检疫提供技术支撑。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

猪伪狂犬病毒基因分型PCR检测方法的建立

为建立一种基因Ⅰ型和Ⅱ型猪伪狂犬病毒(PRV)鉴定方法,对PRV全基因组序列进行生物信息学分析,在Ⅱ型PRV gC基因上鉴定到一段不同于Ⅰ型PRV的47 bp长的多位点稳定差异基序.该方法能特异性区分基因Ⅰ型和Ⅱ型PRV,检测猪瘟病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型及3型时呈阴性.两种...     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

沙门菌毒力基因多重PCR检测方法的建立及应用

通过建立沙门菌不同毒力岛基因的多重PCR,对沙门菌毒力基因进行快速、灵敏的检测。根据GenBank中的序列设计合成16对引物,优化反应条件,建立了4组多重PCR,通过倍比稀释模板检测多重PCR的敏感性。利用建立的多重PCR对124株沙门菌进行毒力基因分布检测,验证多重PCR的实用性。电泳结果显示,多重PCR体系可有效扩增出每个目的基因。4组多重PCR体系的DNA敏感性分别为50、10、50、100pg;菌液敏感性分别为1×104、1×104、1×105、1×105 CFU。多重PCR与单基因PCR检测沙门菌毒力基因的结果一致。结果表明,本研究建立的多重PCR可有效检测沙门菌毒力岛基因,特异性强,灵敏度高,耗时短;还可用于沙门菌毒力基因的鉴定及分子流行病学调查。     

鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。     

泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

牛霉形体PCR检测方法的建立

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法.并对该方法进行了敏感性和特异性试验.该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(M.agalactiae)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性.利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法.     

副猪嗜血杆菌和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种特异性鉴别副猪嗜血杆菌(Hps)和猪鼻支原体(Mhr)的检测方法,对Hps的P2蛋白基因和Mhr的P37蛋白基因分别设计了1对引物,建立Hps和Mhr双重PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度试验,同时应用所建立方法对临床样品进行检测。结果显示,该方法可特异性检测出Hps和Mhr,对其他细菌无非特异性扩增,检测灵敏度可达到100 copies;并可根据扩增产物的大小区分Hps P2蛋白基因的Ⅰ和Ⅱ两个基因型,初步判定Hps的致病性。对32份呼吸道疾病临床样品的检测结果显示,Hps和Mhr阳性率分别为59.4%和53.1%,双重感染的样品为34.4%。表明,成功建立了一种灵敏、特异和快速的双重PCR方法,实现了Hps和Mhr的同时、快速、准确诊断。     

PEDV-TGEV-RV三重PCR检测方法的建立

根据G en Bank中已登陆的猪流行性腹泻病毒(PED V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PEDV的N基因、TGEV的M基因、RV的VP7基因的目的片段;通过优化反应体系,建立了同时检测PEDV、TGEV、RV的三重PCR检测方法。敏感性和特异性试验的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为39.5 pg(PEDV)、38.1 pg(TGEV)和51.6 pg(RV)。该方法可同时扩增477 bp(PEDV)、263 bp(TGEV)、355 bp(RV)的特异性基因片段,而对猪瘟病毒(CSF V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等病毒的检测结果均为阴性。三重PCR与单一PCR的符合率为100%。上述结果表明,该方法的建立对于这3种病毒的临床快速检测与流行病学调查具有十分重要的意义。     

粪肠球菌PCR检测方法的建立

为建立一种基于细菌16 S rDNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于检测临床样本和鉴定分离纯化的细菌,通过比较肠球菌间16 S rDNA的差异,设计了1对特异性引物,并对PCR反应条件进行了优化,对PCR的特异性和敏感性进行了检测。结果显示,粪肠球菌ATCC29212及42个鉴定阳性的临床分离株为PCR阳性,检测结果与16 S rDNA测序的鉴定结果一致,其他种属的4株菌为PCR阴性,所得扩增条带单一且与预期的产物大小一致,测序表明该条带为目的条带;该方法的最小检出量为134 CFU,并能直接对病料进行检测。表明所建立的PCR方法能特异地检测粪肠球菌,且敏感、简易、快捷,适用于实验室的日常检测。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法.结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性.与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性.表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测.     

猫杯状病毒纳米PCR检测方法的建立

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法.结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏感性良好,最低检测量为5.4×10-3 pg/μ L的标准品,...     

水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建立

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到N基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,N基因与参考序列同源性高达 99%。同时根据克隆产物进行亚克隆 ,建立了VSV的PCR检测方法。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为 －3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。