利用杆状病毒表达系统表达猪IFN-L3及其抗PEDV活性的研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞上表达重组猪干扰素L3(rPoIFN-L3)进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究。首先通过间接免疫荧光和Western-blot验证rPoIFN-L3表达,并用Protein A亲和层析柱进行蛋白纯化;采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV~*GFP)检测rPoIFN-L3的抗病毒活性,含rPoIFN-L3的细胞上清的抗病毒活性为1×10~3AU/mL,纯化的rPoIFN-L3抗病毒活性为5×10~5AU/mg。进一步对纯化的rPoIFN-L3蛋白在IPEC-J2细胞上进行抗PEDV活性探究,结果显示,rPoIFN-L3可呈剂量依赖性抑制PEDV复制,并且上调相关干扰素-刺激基因(ISGs)的表达。由此证明,本研究表达的rPoIFN-L3具有抗病毒活性,并可有效抑制PEDV在IPEC-J2上的复制,对预防和治疗PEDV感染有重要意义。     

猪瘟病毒E2蛋白B细胞识别基序的筛选

根据猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的序列设计并人工合成18条重叠多肽,与载体蛋白BSA偶联后,利用抗CSFV E2蛋白单克隆抗体SWmAb8筛选该蛋白上的B细胞表位;同时用12肽噬菌体随机肽库淘选E2单抗识别多肽序列。结果显示,多肽序列VSPTTLRTEV能被单抗SWmAb8识别;含SPTxLR基序的噬菌体能被单抗SWmAb8结合,且能被病毒抗原竞争性抑制。证实SPTxLR基序很可能是E2蛋白的线性表位之一,可诱导机体产生中和抗体。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly (I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDV M蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达栽体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达.结果显示,重组茵pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)...     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对IFN-β激活的JAK/STAT信号通路的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白nsp1对干扰素(IFN)激活的Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的影响,将PEDV nsp1蛋白表达质粒转染HeLa细胞,并用IFN-β处理,应用Western-blot对STAT1、STAT2磷酸化以及早幼粒细胞白血病蛋白(PML)表达水平进行检测,应用IFA试验对STAT1、STAT2核移位以及PML蛋白表达水平进行检测,应用双荧光素酶分析系统对干扰素刺激反应元件(ISRE)-Luc进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56以及PML转录水平进行检测。结果显示,nsp1蛋白过表达细胞内STAT1和STAT2的蛋白表达水平、磷酸化作用以及磷酸化STAT1(pSTAT1)、pSTAT2的核移位不受影响,而ISRE启动子的表达水平受到显著抑制,ISG15、ISG56转录水平显著下调,PML转录水平和蛋白表达水平显著降低。结果表明,PEDV nsp1蛋白可以抑制IFN-β激活的JAK/STAT信号通路。     

脂肪酸合成酶抑制剂C75对日本脑炎病毒感染力的影响

为初步探究宿主细胞脂肪酸合成酶(FASN)在日本脑炎病毒(JEV)感染细胞过程中的作用机制,采用FASN的特异性酶活性抑制剂C75进行体外和体内试验,观察其对病毒感染力的影响。分别以不同浓度的C75(0、10、20μmol/L)作用细胞,通过噬斑试验检测病毒量,Western-blot检测E蛋白的表达量,Q-PCR检测病毒NS1mRNA的表达水平,激光共聚焦试验观察病毒蛋白与FASN的位置关系,体内抗病毒试验验证C75的抗病毒效果。结果显示,在体内、外试验中,C75抑制FASN酶活性后,JEV的感染量均下降;FASN与JEV的NS3、NS5蛋白以及病毒RNA均存在共定位现象。结果表明,FASN在JEV感染时起重要作用,且C75在体内外均具有抗JEV感染的作用。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE基因在原核表达载体pET-32a(+)中的表达产物,并检测表达产物的生物活性,根据猪流行性腹泻病毒COE基因的全序列设计引物,以pCMV-PEDVCOE质粒作为模板,通过PCR扩增得到COE基因编码区的序列,将其克隆至含有6×His tag的原核表达载体pET-32a(+)中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,以此纯化产物为包被抗原建立了ELISA检测方法,并用该方法对39份感染PEDV猪血清进行了检测。结果显示,COE基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,获得与预期分子质量相符的融合蛋白条带。经Western-blot检测,该蛋白能与Anti-PEDV单克隆抗体发生特异性反应。该融合蛋白纯化、复性后的质量浓度为0.7mg/mL。采用以融合COE蛋白为包被抗原建立的ELISA对39份PEDV感染猪血清的检测结果都为阳性,说明该融合蛋白具备作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法的潜力。     

姜黄素抑制PEDV感染Vero细胞的作用研究

为探究姜黄素是否具有抑制猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染的作用,本研究以Vero细胞为实验对象,分别设置阴性（空白）对照组、PEDV感染组、姜黄素处理组、姜黄素预处理后感染PEDV组,在PEDV感染后观察细胞病变,利用RT-qPCR、Western-blot、IFA技术和病毒滴度测定法检测PEDV在Vero细胞中的增殖情况。结果显示,与阴性对照组相比,PEDV感染Vero细胞后有明显细胞病变,即细胞拉丝、细胞核固缩并空泡化。与PEDV感染组相比,姜黄素预处理后显著抑制了病毒在细胞内的增殖（P<0.05）,降低了病毒感染后的滴度（P<0.05）,显著上调了Vero细胞抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平及MX1、ISG15、ZAP的转录水平（P<0.05）。与阴性（空白）对照组相比,PEDV感染后抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平明显上调（P<0.05）,但MX1、ISG15、ZAP的转录水平无显著变化（P>0.05）;姜黄素处理后除IFN-α分泌水平无明显变化外,IFN-β分泌水平及MX1、ISG15、ZAP转录水平均显著上调（P&l...     

PEDV结构蛋白S和M在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒鉴定

为在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M蛋白,并探讨S和M蛋白能否自动组装成病毒样颗粒(VLPs)分泌至培养基中,本研究构建了 3种不同的重组质粒(pFastBac-S、pFastBac-M和pFastBac-S-M),转化入DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定获得重组Bacmid,通过转染...     

基于猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN株S1蛋白的基因序列(GenBank:JQ517274)构建哺乳动物细胞重组表达质粒pIRES-S1。利用电转法将pIRES-S1转染至ST细胞,经过G418加压筛选、Western-blot检测、悬浮驯化后,得到能表达S1蛋白的ST稳转细胞池。Western-blot结果显示,S1蛋白具有良好的反应原性。以S1蛋白作为包被抗原初步建立间接ELISA方法,并对PEDV临床血清和进口种猪PEDV阴性血清进行检测,以血清中和试验为标准,结果显示,该ELISA方法敏感性为96.3%,特异性为97.7%,与血清中和试验具有很高的一致性(kappa值=0.882,P0.05)。应用ELISA方法对PEDV返饲猪跟踪血清检测,结果显示,该方法能准确地评估感染猪体内PEDV IgG抗体水平消长规律。上述结果表明,本研究建立的基于S1蛋白的ELISA方法具有高敏感性和高特异性,可用于临床猪血清中PEDV抗体的检测,为猪群PEDV的免疫评估提供有效依据。     

基于乙肝核心抗原和猪流行性腹泻病毒S蛋白B细胞复合表位基因重组疫苗的免疫原性研究

为了研制新型、有效的猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗,本研究以乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)作为多表位免疫原的载体蛋白,将PEDV S蛋白中的3个B细胞表位基因与S1截短序列基因串联后,插入到编码HBcAg的免疫显性区的基因中,构建重组质粒HBcAg-PE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白HBPE经过纯化和Western-blot鉴定后,以不同剂量的重组蛋白通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,对其免疫效果进行了初步评价。结果显示,重组蛋白HBPE在BL21(DE3)中以沉淀形式表达,纯化、复性后的重组蛋白HBPE能够与PEDV阳性血清发生特异性反应。重组蛋白HBPE能够刺激小鼠产生抗PEDV特异性抗体,同时可以产生相关的Th1型和Th2型细胞因子。上述结果表明,本研究成功构建了PEDV重组B细胞复合表位抗原HBPE,并在小鼠模型中初步评价了其免疫原性,为今后新型PEDV基因工程疫苗的研制提供了新的思路。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M     

马齿苋多糖对猪流行性腹泻病毒抑制作用的研究

提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0～25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25～25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用

分别以猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪轮状病毒(Po RV)VP6基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因、猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Npro基因为靶基因,参照Gen Bank上登录的基因序列,利用DNAStar和Oligo7软件设计了4对引物。采用PCR分别扩增各病毒基因,并克隆至p MD18-T载体,获得4个阳性重组质粒。以重组质粒为模板,进行多重PCR方法的优化。特异性试验检测可分别扩增出相应的病毒基因片段;敏感性试验结果显示,检测PEDV、TGEV、Po RV及BVDV质粒的最低拷贝数分别为730copies/L、547 copies/L、6.47×103copies/L、705 copies/L。应用该方法对猪场44份猪腹泻样品进行检测,结果检出15份PEDV样品,3份TGEV样品,2份BVDV样品,其中PEDV与TGEV混合感染样品2份,TGEV与BVDV混合感染样品1份。随机抽取其中2份PEDV阳性样品进行病毒分离,病毒经细胞传3代以上PCR检测均为阳性,对PCR产物测序证实为PEDV。结果表明,本研究建立的多重PCR方法具有快速、简便、特异性强、敏感度高的特点,能够对PEDV、Po RV、TGEV和BVDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

CVN重组蛋白体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

本研究以Gen Bank中蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)基因序列(DQ668406.1)为基础,合成CVN基因,构建表达质粒pMAL-c5x-CVN,通过优化诱导条件,表达出可溶性CVN重组蛋白。利用cck8试剂盒检测CVN重组蛋白对Marc-145细胞的毒性,并在安全浓度范围内进行了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)试验。在PRRSV感染Marc-145细胞的吸附、穿入和复制三个阶段进行检测,探究CVN体外抗PRRSV的作用效果。各阶段的病毒TCID_(50)检测、间接免疫荧光试验以及qPCR测定结果表明,CVN在PRRSV感染宿主细胞过程中的入侵阶段发挥阻断作用,而在病毒吸附细胞和在细胞内复制的阶段没有抑制效果。本研究为新型抗PRRSV药物的研发奠定了试验基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的构建

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,以分离鉴定的HP-PRRSV CQ株的GP5和M蛋白的全部编码基因为模板,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统,共表达GP5蛋白和M蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blot对重组蛋白进行定性分析;通过透射电子显微镜对病毒样颗粒进行直观的形态学鉴定。结果表明,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统能够成功地共表达重组质粒pFastBac1-GP5-M的GP5蛋白和M蛋白,并能自动装配成病毒样颗粒,显示具有与天然蛋白类似的免疫原性;电镜观察到病毒样颗粒的形态与文献中描述一致,直径约为50nm。本试验结果为猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒疫苗的研究奠定了基础。