兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸。将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%~97.5%,氨基酸同源性为94.3%~99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析。     

兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法。根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,设计合成6对特异性引物和10条搭桥引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒p MD-19T-RHDV2、p MD-19T-RHDV441和p MD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示,建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp,RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和沙门菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示,人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。     

无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达

分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEXHTb VP3中切取GPVH 1株VP3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

羊O/P液中Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因3''端序列的分析

从宁夏中卫Asia Ⅰ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液(OPF)中扩增得到了4个口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因3'-端483 bp(VP483)片段.核苷酸和氨基酸序列比较结果表明,从4份OPF中扩增出的VP1片段,在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDV Asia Ⅰ型流行毒相比均发生了改变,由RGD变成RDD.4个扩增片段的核苷酸序列与Asia Ⅰ/JS/WX/05株相比,同源性为96.2%～98.3%,表明与Asia Ⅰ/JS/WX/05株高度同源.蛋白结构模拟结果显示,这种改变会导致G-H环柔性减弱,这可能是Asia Ⅰ/JS/WX/05 FMDV适应羊体,造成持续感染后发生的一种变异.     

家兔出血症病毒VP60基因特异性噬菌体展示肽库的构建及鉴定

本研究旨在构建家兔出血症病毒VP60基因特异性噬菌体展示肽库,并选用已知表位序列的单克隆抗体对VP60基因特异性肽库进行鉴定,以确定所构建肽库的特异性和丰富性。利用DNA酶Ⅰ随机消化法构建VP60基因噬菌体随机肽库。采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术,选用1B8、1D4、5H3和A3C 4株纯化的单克隆抗体对该肽库进行抗原表位的鉴定。结果显示,所构建多肽库的滴度约为2.6×1012 PFU/m L,能够满足鉴定VP60蛋白的抗原表位的要求,同时鉴定到4条与VP60蛋白高度同源的序列,分别为N(326)PISQV(331)、D(338)MSFV(342)、K(562)STLVFNL(569)和G(25)TTTDGMDPGVVAA(38),与已知单抗所对应的表位序列高度同源。本研究成功构建了家兔出血症病毒VP60基因特异性随机肽库,选用已知表位序列的单克隆抗体对构建的肽库进行鉴定,鉴定到的表位与目前已经报道的单抗针对的表位序列高度同源,表明所构建肽库的特异性和丰富性良好,为进一步筛选和丰富VP60抗原表位奠定基础,还可用于VP60与受体结合域的鉴定,对阐述RHDV的感染、致病和免疫保护机制具有重要意义。     

A型塞内卡病毒衣壳蛋白的原核表达及其五聚体的组装

为实现A型塞内卡病毒(SVA)衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并组装为五聚体,本试验以带His标签和SUMO(小泛素样修饰系统)标签的pSMK及pSMA为载体,将塞内卡病毒衣壳蛋白基因VP0、VP1和VP3构建为重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMK-VP3,在大肠杆菌原核表达系统中对其进行共表达并优化诱导表达条件,包括诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导前细菌D_(600)值以及诱导时间,纯化后获得SVA衣壳蛋白后进行免疫印迹分析,之后利用His-SUMO蛋白酶切除标签蛋白,在体外进行组装和鉴定。结果,A型塞内卡病毒衣壳蛋白VP0、VP1、VP3在20℃下、D_(600)值为1.1、 IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导12 h后蛋白表达效果最好。经超声破碎、镍柱纯化后获得VP0、VP1、VP3蛋白,免疫印迹结果表明,目的蛋白能与SVA阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。动态光散射和扫描电镜检测结果显示,去除His-MUMO后还原天然构象的目的蛋白可组装成五聚体。上述研究结果为制备SVA病毒样颗粒奠定了物质基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达水貂肠炎细小病毒(MEV)VP2衣壳蛋白,以制备抗VP2超免疫血清。根据VP2的基因序列,设计1对特异性引物,以MEV全基因组重组质粒p B-MEV-L为模板,利用PCR技术扩增出MEV VP2片段,并定向克隆到pET-32a载体中,经酶切与序列测定,证明成功构建了VP2基因原核表达质粒pET-MEV-VP2。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后实现了高效表达。免疫印迹试验表明,获得的重组蛋白具有较好的反应原性。以该蛋白为免疫原免疫新西兰兔,制备抗血清,四免后用ELISA方法检测其效价达到1∶1 024。免疫荧光试验证明,获得的抗体具有良好的结合活性。为MEV的病原生物学研究奠定基础。     

家兔出血症病毒病毒样颗粒疫苗的研制及评价

为研究重组杆状病毒RHDV-VP60株表达VP60蛋白及其效果的情况,将RHDV-VP60株接种Sf9细胞制备家兔出血症病毒样颗粒蛋白,与铝胶佐剂混合制成灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果显示,3批VP60蛋白病毒样颗粒抗原液的血凝效价为1∶2~(18)～1∶2~(19)。3批疫苗以超剂量(每只2.0 mL)免疫家兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为每只0.5 mL;免疫后第14天,血清RHDV HI效价为1∶16～1∶64,攻毒后5/5健活;疫苗免疫持续期达210 d。上述研究结果表明,重组杆状病毒RHDV-VP60株可高效表达VP60蛋白并能形成病毒样颗粒,用其制备的疫苗安全性及免疫效果良好,解决了传统疫苗生产过程所存在的生物安全风险以及重组蛋白表达量低的问题。     

兔出血症病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种可视化的兔出血症病毒RT-LAMP检测方法,根据兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的主要结构蛋白VP60基因的序列设计合成4条特异性引物,以重组pMD19-T-VP60质粒为模板,通过反应条件与反应体系优化,建立RHDV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定RT-LAMP对RHDV的最低检测限,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,该RT-LAMP的最佳反应温度为62℃,反应时间为40 min,对RHDV的最低检测限为50 copies/L,常规RT-PCR的检测限为5×10~3copies/L,表明建立的RT-LAMP的灵敏度显著高于常规RT-PCR。建立的RT-LAMP的全部反应可在1 h内完成;反应结束后加入荧光染料Et Br可肉眼判定粉色为阳性,而棕色则为阴性,且与兔巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌及肺炎克雷伯菌无交叉反应。上述结果表明,建立的RT-LAMP简便、快速、灵敏、特异,且不需昂贵仪器设备,适合在基层推广应用。     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定

为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为建立兔出血症病毒(RHDV)的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定.结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1(AD4,AG10,DE2)、IgG2b(BC9,BE8)和IgM(BH3)亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位.     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

脑心肌炎病毒衣壳蛋白VP3真核表达载体pCMV-HA-VP3的构建及融合表达

为构建脑心肌炎病毒(EMCV)衣壳蛋白VP3的真核表达载体pCMV-HA-VP3,以期实现其在HEK293、BHK21及HeLa这三种不同细胞中的表达。提取脑心肌炎病毒RNA,通过RT-PCR、酶切与连接等方法构建重组质粒pCMV-HA-VP3,将表达载体转染进HEK293、BHK21及HeLa这三种不同细胞中,利用RT-PCR进行基因表达情况检测,采用Western-blotting和IFA对融合蛋白在这三种不同细胞中的表达及定位情况进行分析。结果显示,成功构建了衣壳蛋白VP3的真核表达载体pCMV-HA-VP3,并且实现了VP3和HA标签在三种细胞中的融合表达,其在HEK293细胞中表达量最高,其次为BHK21细胞,表达量最低的是HeLa细胞。结果表明,表达的VP3蛋白具有抗原性,且在细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布,为深入研究衣壳蛋白VP3的功能及在EMCV感染过程中筛选与宿主细胞互作的蛋白夯实了基础。