TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

致病性大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

为探讨致病性大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响,本研究从猪外周血分离中性粒细胞,分别用HPI阳性株和HPI阴性株的大肠杆菌感染细胞,于大肠杆菌感染后的第2、6、12、24小时收集细胞,应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4、NF-κB、My D88、IκB-αm RNA表达水平,ELISA检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α和IL-1的含量变化。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染后,TLR4/NF-κB信号通路中各基因的表达及炎性因子TNF-α和IL-1的含量普遍呈上调趋势,均高于对照组,且HPI阳性组基本高于HPI阴性组。由此可知,大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路具有激活作用,其通过上调TLR4、NF-κB、My D88、IκB-α的表达而促进炎性因子TNF-α和IL-1的释放,诱发炎症反应。     

不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞对NF-κB及LAP表达的影响

为了观察不同浓度脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞NF-κB及LAP基因表达的影响,设置不同浓度(0、50、100、200、400和800ng/mL)的脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞,分别于刺激2、4、8、16、24、48和72h后提取细胞总RNA,经反转录反应后,运用荧光定量PCR方法检测NF-κB P65亚单位和LAP的表达水平。结果,与空白对照组相比,脂多糖浓度达到400ng/mL并培养72h后,奶牛乳腺上皮细胞NF-κB P65亚单位和LAP的表达量最高,且与对照组有极显著差异(P<0.01)。结果表明,在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性效应中,NF-κB的表达活性增强,调控着防御基因LAP表达,呈现一定的剂量和时间效应关系。     

杨树花多糖对河田鸡大肠杆菌病的防治效果及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响

旨在研究杨树花多糖(PFP)对大肠杆菌感染河田鸡的防治效果。将225只1日龄河田鸡随机分为9组,分别为空白组、模型对照组、阳性对照组与预防组(高、中、低)、治疗组(高、中、低),每组25只,连续用药6 d后,观察7 d。通过Western-blot检测TLR4、Myd88及NF-κB蛋白水平,通过qPCR检测IL-6、TNF-α的m RNA表达水平,初步探讨其作用机制。观察发现,杨树花多糖防治组鸡的精神状态和模型组相比显著改善,组织器官的症状及病理变化显著减轻。Western-blot结果显示,杨树花多糖防治组TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达量下调明显,且呈现出剂量依赖型。qPCR结果显示,杨树花多糖防治组IL-6、TNF-α的表达量显著低于模型对照组(P0.05),其中预防高剂量组IL-6 mRNA表达量与恩诺沙星组差异不显著(P0.05),但TNF-α mRNA表达量显著低于恩诺沙星组(P0.05)。结果说明,杨树花多糖能有效清除大肠杆菌的毒力因子,对河田鸡大肠杆菌病有较好的防治效果。     

TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测

采用肾小管节段贴块法培养小鼠原代肾小管上皮细胞,用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞种类,并用RT-PCR检测了原代肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7基因的表达情况。结果表明,TGF-β1、Smad4和Smad7基因在肾小管上皮细胞中均有表达。这为探讨上述基因在肾间质纤维化中的作用奠定了基础。     

食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒感染中NSP1及IκB/NF-κB通路mRNA表达的影响

为探究食淀粉乳杆菌对轮状病毒感染中NSP1及NF-κB通路mRNA表达的影响,将食淀粉乳杆菌及其分泌上清分别作用于轮状病毒感染的乳鼠和IPEC-J2细胞,采用荧光定量PCR技术测定各组NSP1和IκB/NF-κB通路的mRNA水平变化。体内与体外试验结果显示,食淀粉乳杆菌及其分泌上清可显著下调NSP1 mRNA的表达(P0.05)。体外试验中,预防性干预组(BI组)IκB、NF-κB整体趋势相似,与正常对照组相比NF-κB mRNA上调显著(P0.05),与轮状病毒组(RV组)和治疗性干预组(AI组)相比表达相对平稳,IκB mRNA在第4到6小时上调显著(P0.05);体内试验中,在乳鼠感染轮状病毒的3 d内BI组NF-κB mRNA显著上调且与RV组和AI组差异显著(P0.05);第3天时BI组IκB mRNA水平上调高于RV组和AI组且差异显著(P0.05),RV组和AI组无显著性差异(P0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌及其分泌上清能够有效下调猪轮状病毒NSP1的mRNA表达,在激活IκB/NF-κB通路、提高机体先天性免疫方面具有积极作用,而且预防作用优于治疗作用。     

猪NF-κB真核表达载体的构建及转染Marc-145细胞对PRRSV增殖的影响

为研究猪细胞核转录因子-kappa B(NF-κB,p50/p65)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外增殖的影响,从猪外周血淋巴细胞扩增NF-κB p65ORF和p50RHD功能区,分别克隆至pcDNA3.1(+),经酶切及测序鉴定,获得pcDNA3.1(+)-p50-RHD及pcDNA3.1(+)-p65。将其转染至Marc-145细胞,Western-blot检测胞核内p50、p65的表达水平。pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-p50-RHD、pcDNA3.1(+)-p65和pcDNA3.1(+)-p50-RHD+pcDNA3.1(+)-p65分别转染Marc-145,18h后接种PRRSV,采用实时荧光定量PCR检测培养上清病毒粒子增殖时相,绘制一步生长曲线。结果表明,成功构建了猪NF-κB p50、NF-κB p65真核表达载体,且可在Marc-145细胞中表达。转染p50+p65、p65真核表达质粒可加速PRRSV感染Marc-145细胞后CPE进程,抑制PRRSV增殖,极大降低病毒效价,且p50+p65抑制作用更强;转染p50质粒则推迟CPE出现,减缓PRRSV增殖,但对病毒效价影响不大。本研究结果表明,NF-κB p50/p65、p65/p65对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有一定的抑制作用。     

环腺苷酸对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖的影响

用环腺苷酸 (cAMP)对体外培养的山羊乳腺上皮细胞 (GMEC)进行试验 ,将细胞分为 8组。第 17组分别加入 1× 10、1× 10 2 、1× 10 3 、1× 10 4、1× 10 5、1× 10 6、1× 10 72nmol L的cAMP ;第 8组不加cAMP为对照组。结果显示 ,第 16组细胞倍增时间随cAMP浓度升高而递减 ,分别为 31.7、2 9.8、2 7.8、2 5 .6、2 3.8和 2 2 .0 2h ;当cAMP浓度达到 1× 10 72nmol L时 ,细胞倍增时间反而延长 2 6 .5 2h ,对照组细胞倍增时间为 30 .6 2h。结果表明 ,在一定浓度范围内 ,cAMP对GMEC有促进增殖作用 ,当cAMP浓度过高时则有抑制作用。cAMP对该细胞生长曲线的影响是在对数生长期。Westernblot结果证实 ,体外培养的细胞为GMEC ,cAMP诱导了该乳腺上皮细胞特异性产物酪蛋白的表达。     

IGF-I和EGF对牦牛乳腺上皮细胞SND1表达的影响

本研究旨在研究不同浓度胰岛素样生长因子I(IG F-I)和表皮生长因子(EGF)对牦牛乳腺上皮细胞SDN1(金黄色葡萄球菌核酸样都铎域1)表达的影响。选取纯化的第3代牦牛乳腺上皮细胞,分别加入0、50、100、200 ng/m L IGF-I或EGF,通过实时荧光定量PCR和免疫荧光检测它们对SND1基因表达及表达蛋白分布的影响。实时荧光定量PCR和免疫荧光分析显示:IGF-I可提高牦牛乳腺上皮细胞SND1基因的表达,且具有浓度依赖性,当IGF-I浓度为200 ng/m L时,SND1基因的白表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05);EGF也可提高SND1基因的表达,当EGF浓度为100 ng/m L时,SND1基因和的表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05)。SND1蛋白主要分布于牦牛乳腺上皮细胞胞核中。研究结果表明,IGF-I、EGF可通过调控牦牛乳腺上皮细胞SND1的表达来调节泌乳机能。     

高铜对鸡肝细胞NFκB及相关细胞因子mRNA表达的影响

为了探讨高铜(Cu)对鸡肝细胞NFκB信号分子及细胞因子mRNA表达的影响,本试验分为体内和体外两个部分进行。体内试验选取1日龄健康白羽肉鸡48羽,随机分为4组,每组12羽,并分别饲喂对照日粮(Cu 11 mg/kg,对照组)和高铜日粮(Cu 110 mg/kg,高铜Ⅰ组;Cu 220 mg/kg,高铜Ⅱ组;Cu 330mg/kg,高铜Ⅲ组),于49日龄采集肝,制作组织切片观察肝病理变化,并采用实时荧光定量PCR方法检测NFκB信号通路中相关细胞因子(NFκB、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6和iNOS)的mRNA转录水平。体外试验以不同浓度的硫酸铜(0、10、50、100umol/L)处理鸡胚原代肝细胞24 h,普通光学显微镜观察肝细胞形态,实时荧光定量PCR检测上述基因的mRNA转录水平,并使用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与硫酸铜共同作用于肝细胞后检测上述指标的变化。体内与体外试验结果显示,高铜可致鸡肝细胞损伤,同时诱导NFκB、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、iNOS的mRNA表达显著上调。与硫酸铜单独作用相比,NAC与硫酸铜联合作用可缓解肝细胞的损伤,上述基因的mRNA转录水平也显著下调。结果表明,高铜可激活并调节NFκB及相关细胞因子mRNA的表达。     

PRRSV体外感染Marc-145细胞对NF-κB p65/p50转录时相及核易位的影响

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染对细胞核转录因子-κB(NF-κB,p65/p50)mRNA转录时相及核易位的影响,探讨PRRSV感染导致的免疫抑制与NF-κB的活化异常是否有一定的相关性,运用实时荧光定量PCR技术对PRRSV感染Marc-145细胞不同时期NF-κB p50、p65mRNA的转录水平变化进行定量分析,并提取不同感染时期Marc-145细胞核蛋白,利用免疫印迹法检测细胞核内具有活性的p50、p65水平变化。荧光定量结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第8～12小时,p50、p65转录水平急剧下调,第12～120小时p50、p65mRNA含量一直维持在较低水平,与接毒前及对照组同时期的转录水平相比,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。免疫印迹结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第12～96小时,细胞核内均未检测到p50的表达;感染后第12小时,细胞核内p65表达下调,第48～96小时未检测到p65的表达。可见,PRRSV体外感染Marc-145细胞能够抑制NF-κB p65/p50mRNA的转录及核易位。以上结果支持PRRSV感染早期无力的先天性免疫应答可能与NF-κB活化水平的低下有关的观点,为进一步研究PRRS的感染机制及NF-κB的功能提供新的思路和依据。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11 d和8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。     

翁苋颗粒对患鸡白痢雏鸡chTLR4和IL-1β及TNF-α mRNA表达的影响

为探讨翁苋颗粒对雏鸡感染鸡白痢后chTLR4、IL-1β、TN F-αm RNA表达的影响。采用腹腔注射鸡白痢沙门菌菌液的方法人工复制鸡白痢的病理模型,通过在饲料中添加一定比例的翁苋颗粒,于试验后各组随机取雏鸡剖解采样,检测法氏囊组织中chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达量。结果显示,与空白组比较,感染对照组雏鸡法氏囊chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平升高,差异极显著(P0.01);与感染对照组比较,翁苋颗粒组、药物对照组雏鸡法氏囊chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平降低,差异极显著(P0.01)。结果表明,翁苋颗粒可通过下调chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA的表达水平,从而起到防治雏鸡白痢的作用。     

鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响

为探索鸭疫里默氏杆菌的致病机制,研究了鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响.结果显示,鸭疫里默氏杆菌AF株的培养滤液能使鸭胚成纤维细胞形态发生变化,表现为细胞膜和细胞质逐渐丢失、核浓缩等;90%(27/30)的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株能液化明胶,具有致病性,培养滤液具有改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;10%(3/30)的菌株不液化明胶,无致病性,培养滤液无改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;经硫酸铵盐析、阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析,从AF株培养滤液中分离获得分子质量约为55 ku、能水解明胶及改变细胞形态的活性蛋白质.证实,降解明胶的蛋白水解酶是鸭疫里默氏杆菌培养滤液影响鸭胚成纤维细胞形态的活性物质,可能是细菌的毒力因子之一.     

阿维菌素对体外培养王鸽神经细胞内游离钙离子浓度及CaM mRNA表达的影响

提取美国王鸽8～9日龄鸽胚脑神经细胞进行体外培养,按照阿维菌素(AVM)染毒的剂量分成4组,分别为0ìg/L(Ⅰ组)、2.5 ìg/L(Ⅱ组)、5 ìg/L(Ⅲ组)和10 ìg/L(Ⅳ组),染毒24 h后,用MTT法进行细胞活性检测,应用荧光探针法检测细胞内游离Ca2+浓度,应用半定量RT-PCR法检测细胞内CaM mRNA的表达水平.结果显示,AVM能够引起王鸽神经细胞内游离Ca2+浓度升高,CaM mRNA表达水平下降.表明AVM能影响王鸽体外培养神经细胞内的钙稳态.     

丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的影响

用丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞进行处理,观察它们对小鼠胎儿成纤维细胞分裂与存活的影响。结果表明,小鼠胎儿成纤维细胞用不同浓度的丝裂霉素 C或不同强度的γ射线处理一定时间(5μg/mL 4 h、10μg/mL 1~4 h、20μg/mL 1.0~2.5 h 或14 Gy 1 h、21 Gy 1h、28 Gy 1 h),能有效地抑制其分裂,且不影响其活力。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

JA1对体外培养的Hep细胞和小鼠皮下移植性Hep细胞凋亡的影响

采用噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞术、光镜及透射电子显微镜技术等检测了梯度浓度的JA1(沙冬青提取物)对体外培养的小鼠肝癌细胞株Hep增殖的影响及诱导Hep细胞凋亡的作用;并检测了JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞的生长抑制及诱导凋亡作用.结果显示,JA1可显著抑制小鼠Hep细胞的增殖,且这种抑制有浓度和时间依赖性.流式细胞仪分析显示,JA1处理后的Hep检测样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生了改变,细胞在G1期被阻滞.同时,JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞也有明显的抑制作用.JA1灌胃试验组瘤组织细胞DNA直方图有明显的凋亡峰,细胞在G1期也被阻滞,光镜和电镜下可见大量凋亡肿瘤细胞.     

17β-雌二醇对海马组织结构和GFAP表达的影响

为研究17β-雌二醇对脑的保护作用机制,以去卵巢大鼠为动物模型,采用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和透射电镜技术,观察了17β-雌二醇对海马组织结构和胶质纤维酸性蛋白表达的影响。结果显示:①与对照组、假手术组和去卵巢后补充雌激素组比较,在去卵巢组中,海马CA1～3区、齿状回神经元数量显著减少(P<0.05),CA4区神经元数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量增加不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达增加,除CA4区与去卵巢后补充雌激素组之间无显著差异外(P>0.05),其余均差异显著(P<0.05);海马CA1区神经元、胶质细胞线粒体肿胀,神经元突触和突触囊泡减少,轴突变性;②与去卵巢组比较,去卵巢后补充雌激素组海马CA1～3区、齿状回神经元数量明显增加(P<0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～3区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达显著降低(P<0.05);保持了海马CA1区神经元和胶质细胞超微结构的正常。结果表明,17β-雌二醇能通过增加神经元数量,降低星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白表达,保持神经元和胶质细胞正常的超微结构,实现对海马的保护。