牛带绦虫8ku蛋白基因家族cDNA的克隆和序列分析

根据带科绦虫8ku蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对牛带绦虫六钩蚴总RNA进行扩增,扩增产物经胶回收试剂盒纯化,与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,筛选含有阳性重组DNA的克隆,对阳性克隆进行测序。使用DNAStar和MAGE 4生物学软件对基因克隆进行序列分析和进化树分析。结果显示,成功克隆了5种牛带绦虫8ku蛋白基因家族新成员,cDNA序列完整开放阅读框的大小为258bp,TSA8ku-1cDNA为优势克隆。序列同源性分析表明,各cDNA克隆氨基酸序列之间的差异性为1.2%～14.2%,与猪带绦虫诊断抗原TsRS1群(组)成员同源,相似性为85.9%～88.9%。由此可以推测,克隆的5种8ku蛋白基因家族成员可能是牛带绦虫病的重要诊断抗原候选基因。     

猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(PKA-C)基因的鉴定及表达

为鉴定猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基基因(Ts PKA-C),分析其作为诊断抗原的可行性,利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计猪带绦虫Ts PKA-C特异引物,以猪带绦虫成虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增Ts PKA-C基因的完整ORF,并通过生物信息学分析进行鉴定。构建p ET-30a(+)-Ts PKA-C重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,Ts PKA-C的ORF由1 032个核苷酸组成,编码343个氨基酸残基,与细粒棘球蚴和多房棘球蚴氨基酸序列的一致性分别达78.7%和98.0%;Ts PKA-C具有蛋白激酶A的结构域及其催化亚基特征性活性位点,且存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。Ts PKA-C基因的表达产物主要以包涵体形式存在,且可与猪囊尾蚴病阳性血清发生反应,在42 ku处产生特异条带。本研究克隆并鉴定了Ts PKA-C基因,其表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。     

多头带绦虫Tm16基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm16重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增Tm16基因,将扩增产物亚克隆入pET32a(+)载体中,构建pET32a-Tm16表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm16重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,多头带绦虫Tm16基因序列长569bp,包括1个399bp的开放阅读框,与已报道的Tm16基因(序列号:EF672036)的序列同源性为99.8%。表达的重组蛋白大小约为30.69ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫1周后血清中即可检测到抗Tm16蛋白的特异性抗体,并于免疫后第5周达到高峰。结果表明Tm16重组蛋白具有较好的免疫原性,可作为脑多头蚴病疫苗的候选抗原。     

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。     

猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因的克隆与序列分析

为了研究猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的结构特征及编码蛋白的功能,根据GeneDB中获得的2条cDNA序列设计引物,以猪囊尾蚴总RNA为模板进行RT-PCR,获得猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(TsoStefin和TsoCystatin)基因的完整开放阅读框序列,并进行生物信息学分析。结果表明,所获得的2条序列均含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂特征性的结构域。TsoStefin由98个氨基酸残基组成,不含二硫键和糖基化位点,为细胞内蛋白;TsoCystatin由274个氨基酸残基构成,含有1个糖基化位点和2个相似的结构域,第1~18位氨基酸残基组成信号肽,属分泌型蛋白。系统发育树显示,TsoStefin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族1的成员,TsoCystatin属家族2的成员,与部分绦虫的亲缘关系较近。从上述结果推测,所获得的2条基因均属于猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

猪细小病毒Z株NS部分基因的扩增及序列分析

从猪细小病毒Z株提取基因组DNA ,利用PCR扩增部分基因 ,并对该扩增片段进行测序与分析。结果表明 ,扩增的NS基因长 330bp ,编码 10 9个氨基酸。氨基酸序列中含有猪细小病毒的重要保守序列 ,并有 1个潜在的糖基化位点NFSN。Z株NS基因与其他猪细小病毒Kresse、NADL2 2、NADL2 1株的核苷酸同源性分别为 99%、98%、98% ,氨基酸同源性均为 99%。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达及其表达产物的酶学活性分析

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/Zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/Zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/Zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;对表达产物进行W estern-blot检测,并进行酶比活性分析。结果显示,多头带绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列与猪带绦虫和肥头绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列的相似性分别为98%和92%;纯化后的多头带绦虫重组Cu/Zn-SOD蛋白的浓度为1.587 m g/m L;用羟胺法测得该重组蛋白的酶比活性为3 125.64 U/mg±76.82 U/mg;H2O2、SDS和EDTA对重组的多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性具有较强的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素则对多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性并无影响。上述结果为进一步研究多头带绦虫C u/Zn-SO D基因的生物学功能奠定了基础。     

猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定

运用PCR技术扩增3株猪源鹦鹉热衣原体的外膜主蛋白(MOMP)编码基因,将扩增产物连接到pMD 18-T载体克隆,经酶切鉴定、PCR鉴定并分析其序列,3菌株的MOMP核苷酸序列的同源性为98.4%～99.0%,氨基酸序列的同源性为97.5%～98.1%,他们之间的差异很小,属于同一血清型.与国外发表的GPIC株及Mn株的MOMP比较,核苷酸序列的同源性分别为79.5%～80.4%和70.9%～71.3%.氨基酸序列的同源性分别为84.2%～84.7%和80.2%～80.5%.同时发现3菌株与GPIC株具有相似的基因可变区,而与Mn株的差异较大.     

D28k钙结合蛋白cDNA的克隆及序列分析

利用RT PCR技术从鸡小肠组织RNA中扩增鸡D2 8k钙结合蛋白cDNA ,以进一步研究D2 8k钙结合蛋白促进肠钙吸收的机理。结果表明 ,鸡肠道D2 8k钙结合蛋白cDNA的开放阅读框由 789个碱基对组成 ,编码由 2 6 2个氨基酸组成的多肽 ,分子质量约为 2 7.9ku ;禽类D2 8k钙结合蛋白基因长 18.5kb ,10个间插序列将其分成 11个编码外显子 ,启动子区以GC为主 (6 0 %～80 % )。D2 8k钙结合蛋白氨基酸序列的同源性在鼠和人之间达到 98.5 % ,在蟾蜍和鸡之间达到80 .9% ,在人和鸡之间为 79.8% ,在鼠和鸡之间为 79.5 %。不同种属的动物之间D2 8k钙结合蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

禽脑脊髓炎病毒 VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较     

禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因.序列分析表明,该序列全长741 bp,开放阅读框(ORF)为651 bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%.由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因.利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白.将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41 ku的融合蛋白.     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。