基于绵羊肺炎支原体Enolase蛋白建立间接ELISA抗体检测方法

旨在建立一种检测绵羊肺炎支原体(Mo)血清抗体的间接ELISA方法,笔者构建了 Mo Enolase基因原核表达载体,诱导表达后,纯化的重组蛋白用Western-blot分析其反应原性.以重组蛋白为包被抗原,建立了 Mo间接ELISA抗体检测方法.结果显示,重组蛋白得到可溶性表达,Western-blot证实具有良好的...     

绵羊肺炎支原体特异性分子检测靶标的筛选与应用

本文旨在筛选出特异性的绵羊肺炎支原体(Mycoplasmna ovipneumoniae)分子检测靶标,利用全基因组BLASTn筛选出绵羊肺炎支原体特异性蛋白基因序列,再运用NCBI线上Primer BLAST程序,选择G/C含量较高的4个靶基因设计11对引物,通过引物筛选和反应条件的优化,成功筛选到一对针对靶标728...     

猪鼻支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为了检测猪血清中猪鼻支原体(Mhr)的抗体水平,采用脱氧胆酸钠提取Mhr膜蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA,并采用该方法检测了60份SPF阴性猪血清和45份Mhr阳性猪血清样品。结果显示,该方法的特异性为90.5%,敏感性为98.0%。除猪肺炎支原体(Mhp)外,该方法与几种猪病毒阳性血清及副猪嗜血杆菌Ⅳ型阳性参考血清均无交叉反应。对Mhr DL菌株感染的巴马猪血清抗体的检测结果显示,Mhr感染后第3天血清抗体阳转,第35天抗体水平达到高峰,抗体效价为1∶6 400。用该方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒平行检测138份现地血清样品,Mhr和Mhp的阳性检出率分别为71.0%和44.9%。用该方法对黑龙江、吉林、山东等地临床送检的457份血清的检测结果显示,Mhr阳性率为70.3%,表明我国猪群Mhr感染十分普遍。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA具有良好的特异性和敏感性,为Mhr抗体检测提供了技术手段。     

绵羊肺炎支原体P113蛋白C端重复区的表达及其免疫原性

为进一步研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的结构与功能,在进行生物信息学分析的基础上,对编码其C端重复区的基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blotting方法对P113蛋白的免疫原性进行了分析。结果显示,P113蛋白与猪肺炎支原体黏附素P97蛋白高度同源,并具有相似的C端重复区;该区域在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以可溶性的形式存在;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P113蛋白是良好的免疫原。     

猪肺炎霉形体膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

通过提取猪肺炎霉形体ATCC25095株膜蛋白,并用免疫亲和层析柱对膜蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析得到了分子质量分别为66、50、46、42、32和24 ku的6种膜蛋白。以纯化的膜蛋白为包被抗原,建立了检测猪肺炎霉形体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,纯化的抗原具有更好的重复性和敏感性,对临床检测样品的检出率高于IDX ELISA试剂盒。     

绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。     

己烯雌酚单克隆抗体细胞株的筛选及间接ELISA法的建立

以自行合成的己烯雌酚 (DES)免疫原免疫BALB/c小鼠 ,采用细胞融合、显微克隆等单克隆抗体技术 ,制备了 5株抗DES单克隆抗体分泌杂交瘤细胞株 (7B6、4B10、1G10、4E4、2C7) ;选择其中的 7B6株抗体 ,建立了间接竞争ELISA法 (indirectcompetitiveinhibitionELISA) ,通过初步优化 ,其检测限为 10 pg/孔 ,与同类二苯乙烯类雌激素的交叉反应高 ,而与天然雌激素雌二醇几乎无交叉反应性。这项研究为DES残留检测试剂盒的开发打下了基础。     

猪轮状病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,建立检测猪轮状病毒血清抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被量为6μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶5 000。应用该方法检测阴性血清样本30份,确定的检测临界值为0.143(D490nm≥0.143,则判定为阳性)。特异性试验表明,用建立的间接ELISA对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒阳性血清进行检测时无交叉反应。重复性试验证实,批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的用以检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于猪轮状病毒的病原学检测。     

应用TmAdh3重组蛋白建立绵羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的研究

为评价多头带绦虫TmAdh3重组蛋白作为脑多头蚴病诊断抗原的潜力,根据多头带绦虫TmAdh3基因组序列,人工优化合成TmAdh3基因ORF序列并连接至表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,利用Western-blot分析纯化的重组蛋白的反应原性,优化检测条件,建立脑多头蚴病间接ELISA诊断方法并进行评价。结果显示,成功表达了分子质量大小为39.0 ku的重组蛋白rTmAdh3。间接ELISA检测的最适反应条件为：5.00μg/m L重组蛋白rTmAdh3在4℃包被过夜;1∶100稀释血清在37℃孵育30min;1∶10 000稀释的HRP标记的酶标二抗在37℃孵育45 min,底物避光显色10 min。应用建立的方法可检测到人工感染脑多头蚴后第3～8周的绵羊血清;对40份自然感染脑多头蚴的绵羊（剖检确认脑部有包囊）血清的阳性检出率为22.5%(9/40)。与细粒棘球蚴感染绵羊血清和细粒棘球蚴Eg95免疫绵羊血清交叉反应率为5%(4/80)。结果表明,本研究建立的以TmAdh3重组蛋白作为检测抗原的间接ELISA诊断方法可用于绵羊脑多头蚴感染早期的筛选。     

鸭东方次睾吸虫病间接ELISA诊断方法的建立

为评价候选蛋白烯醇化酶(Enolase)作为东方次睾吸虫ELISA诊断抗原的潜力,重组表达东方次睾吸虫烯醇化酶基因,以纯化好的重组蛋白为抗原,优化各检测条件,建立了鸭东方次睾吸虫病间接ELISA诊断方法并用该方法检测临床样品.结果 显示,通过棋盘滴定法,确定了抗原的最佳包被质量浓度为2μg/mL和血清最佳稀释度为1∶1...     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

柔嫩艾美球虫间接ELISA检测方法的建立

将已构建的原核表达载体pET Mzp5 7在大肠埃希氏菌中诱导表达 ,以融合重组蛋白为包被抗原 ,以HRP标记的鼠抗鸡IgG为二抗 ,建立了检测柔嫩艾美球虫抗体的间接ELISA方法。经筛选 ,该方法的最佳反应条件是 :λMzp5 7重组蛋白最佳包被量为 1.0 μg/孔 ,10 0mL/L胎牛血清封闭 ,二抗的最佳工作浓度为 1∶16 0 ,用正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。结果表明 ,建立的间接ELISA方法可用于监测柔嫩艾美球虫抗体 ,且具有快速、简便、成本低等优点     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

基于TPX和CatB4重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA诊断方法的建立

为了建立早期快速诊断绵羊肝片吸虫病的血清学方法,原核表达肝片吸虫TPX和CatB4重组蛋白.分别以TPX、CatB4重组蛋白作为包被抗原,建立2种检测肝片吸虫血清抗体的间接ELISA方法.采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选.蛋白免疫印迹结果显示,重组蛋白...     

绵羊痘病毒A11R基因的优化表达及抗体间接ELISA方法的建立

本研究旨在对免疫原性目的蛋白基因A11R优化表达的基础上建立羊痘血清学检测方法,为羊痘防控提供技术支撑。绵羊痘病毒A11R基因经密码子优化后合成目的基因,连入pET-28a（+）载体,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌,pET28a-A11R经鉴定后进行诱导表达。结果显示,经密码子优化后的A11R蛋白的表达量显著增加,更易从转化的大肠杆菌裂解上清液和经过复性的包涵体中大量纯化获得。将该蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立检测羊痘抗体的间接ELISA方法,并进行特异性和敏感性试验,用该方法与商业化试剂盒对临床样品进行检测。结果显示,A11R蛋白的最佳包被剂量为0.5μg/孔,待检血清最适稀释度为1∶100,家兔抗羊Ig G最适稀释度为1∶20 000。用建立的间接ELISA方法检测小反刍兽疫、羊口疮、口蹄疫的阳性血清,结果均为阴性,无交叉反应,具有良好的特异性。当羊痘阳性血清稀释到1∶1 600时抗体检测仍为阳性,具有较高的敏感性。用该ELISA方法与商业化试剂盒检测临床样品,符合率为98.71%,具有良好的一致性。上述结果表明,本研究建立了基于A11R蛋白的羊痘血清学免疫诊断方法,...     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

PRRS抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法提纯的PRRSVSC2株作为包被抗原,建立了检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA法。该法的最适抗原包被浓度为5μg/mL,最佳酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶5000,对猪抗PRRSV的IgG检测灵敏度达到0.1μg/mL。该法只与PRRS阳性猪血清呈现阳性反应,而与PRRS阴性猪血清和猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪细小病毒病阳性血清呈现阴性反应。应用该法检测PRRSVORF5基因疫苗免疫猪后的抗体消长规律表明,疫苗免疫猪后第7d抗体水平迅速上升,第75d达到高峰,然后缓慢下降,至第135d时仍然极显著(P<0.01)高于空载体对照和空白对照。试验结果表明,该法具有良好的特异性和敏感性,可用于PRRS流行病学调查和PRRSV基因疫苗免疫后抗体水平检测。     

猪SIgA直接ELISA检测方法的建立及应用

采集猪肠黏液并分离纯化出猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA),制备兔抗猪SIgA IgG抗体,经HRP标记,并优化直接ELISA检测猪SIgA的条件,建立了检测猪SIgA的直接ELISA方法。结果显示,筛选的最佳反应条件:黏液蛋白包被浓度为10μg/mL,兔抗猪SIgA IgG-HRP酶标抗体的工作浓度为1∶200,反应时间为60min。包被SIgA浓度标准曲线的线性范围为90～1 400ng/mL,回收率为85.85%～133.88%,变异系数为13.12%～17.67%。采用该方法对猪肺炎支原体灭活疫苗免疫与攻毒后的仔猪肺冲洗液和肠黏液中的SIgA进行检测;结果显示,攻毒后免疫猪肺冲洗液中SIgA含量平均为205.81ng/mL,显著高于攻毒对照猪的147.56ng/mL和空白对照猪的124.37ng/mL(P<0.05);免疫猪肠黏液中SIgA含量平均为67.94ng/mL,与对照猪无明显差异。结果证实,建立的猪SIgA直接ELISA方法具有经济、适用和准确的特点。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——免疫试验

本研究在确证了华池“类山羊传染性胸膜肺炎”是由绵羊肺炎支原体(M.Ovipneu-monia)所致的基础上,又以地方分离株试制浓缩灭活苗3批。通过豚鼠、家兔和山羊、绵羊检验均安全,并免疫山羊12只,攻毒结果,免疫组11/12保护(保护率为91.7％)对照组9/9发病;又以8911批苗免疫绵羊4只,攻毒结果,免疫组4/4保护(保护率为100％),对照组3/3发病。田间小区免疫试验;共免疫绵羊、山羊3672只,另设对照羊1451只,经半年免疫试验观察和抽样攻毒效检,免疫羊保护率为93.9％,其发病率和死亡率比对照群分别降低74.9％和72.6％,以上结果证明了试制三批苗对山羊和绵羊均具有良好的免疫效力。免疫持续期试验,以8810批苗在现地免疫羊865只,对照羊651只,经6、12及18个月的攻毒试验,结果免疫群的保护率分别为96.5％,97.5％,92.8％,免疫群比对照群发病率/死亡率分别降低78.3％/83.0％,86.7％/89.0％,7.06/72.2％,结果证明疫苗的有效免疫持续期为18个月以上。同时以本苗与“古典山传苗”作了6、12个月对比免疫试验,结果“古典山传苗”免疫群比8810批苗免疫群的发病率/死亡率分别高83.4％/93.4％和90.0％/91.1％。并证实两种疫苗间缺乏交叉免疫力。将3批苗保存在4～6℃条件下12个月,在室温(25±5℃)中6个月,其免疫效力不减低。