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相似文献
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1.
为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly (I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDV M蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。  相似文献   

2.
为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。  相似文献   

3.
利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blot和荧光定量RT-PCR检测均表明,SHCM06毒株可感染MDBK、ST和PK15细胞,在MDBK和ST细胞上的增殖效率显著高于PK15细胞。进一步分析SHCM06感染对细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响,结果显示,SHCM06感染均能使3种细胞中IFN-α和IFN-β表达量显著下降(P0.05),且对MDBK细胞IFN-α的抑制效果显著高于对PK15细胞中IFN-α的抑制作用(P0.05)。结果表明,从猪临床腹泻样品中分离1株BVDV1型,该病毒对MDBK、ST细胞适应性好于PK-15细胞,能显著抑制细胞中Ⅰ型IFN的产生,以发挥抵抗细胞抗病毒免疫效应,本试验为深入研究猪源BVDV的致病作用奠定了基础。  相似文献   

4.
为探究姜黄素是否具有抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的作用,本研究以Vero细胞为实验对象,分别设置阴性(空白)对照组、PEDV感染组、姜黄素处理组、姜黄素预处理后感染PEDV组,在PEDV感染后观察细胞病变,利用RT-qPCR、Western-blot、IFA技术和病毒滴度测定法检测PEDV在Vero细胞中的增殖情况。结果显示,与阴性对照组相比,PEDV感染Vero细胞后有明显细胞病变,即细胞拉丝、细胞核固缩并空泡化。与PEDV感染组相比,姜黄素预处理后显著抑制了病毒在细胞内的增殖(P<0.05),降低了病毒感染后的滴度(P<0.05),显著上调了Vero细胞抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平及MX1、ISG15、ZAP的转录水平(P<0.05)。与阴性(空白)对照组相比,PEDV感染后抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平明显上调(P<0.05),但MX1、ISG15、ZAP的转录水平无显著变化(P>0.05);姜黄素处理后除IFN-α分泌水平无明显变化外,IFN-β分泌水平及MX1、ISG15、ZAP转录水平均显著上调(P&l...  相似文献   

5.
TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。  相似文献   

6.
为探讨二甲双胍(Metformin)对水疱性口炎病毒(VSV)复制的影响及其作用机制,笔者利用CCK-8法检测不同浓度Metformin对PK-15细胞活力的影响,同时利用RT-qPCR、Western-blot等技术分析Metformin对病毒复制、细胞因子表达及其作用途径的影响。结果显示,当Metformin的浓度达到10 mmol/L时,细胞的存活率仍接近100%。与未处理的感染细胞组相比,Metformin显著抑制VSV在PK-15细胞和Vero细胞中的复制。进一步的研究发现,Metformin通过激活AMPK、抑制m TOR进而诱导自噬,同时抑制IFN-β、IL-6和TNF-α的表达;敲低自噬关键基因ATG7抑制VSV的复制,并促进IFN-β表达。本研究证实Metformin抑制VSV复制,丰富了Metformin影响病毒复制的网络信号,为病毒病有效防控提供重要的科学依据。  相似文献   

7.
本研究通过实时荧光定量PCR方法,观察皮下注射刺五加多糖(ASPS)对雏鸡血液免疫相关细胞因子IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达水平的影响,从而通过分子水平对ASPS的免疫增强作用进行评价.1日龄海兰褐公雏饲养至7日龄时选取150只,随机分为3组,每组5...  相似文献   

8.
为探究白藜芦醇(RSV)对玉米赤霉烯酮(ZEA)致睾丸支持细胞氧化损伤及凋亡的保护作用,以小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞为研究对象,分别设对照组、ZEA组(20μmol/L)、RSV组(5μmol/L)、ZEA+RSV组(5μmol/L RSV处理30 min后+20μmol/L ZEA),24 h后,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡率,试剂盒检测细胞内MDA含量和SOD活力,免疫荧光法结合流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western-blot检测Fas/FasL通路相关蛋白表达。结果显示,与对照组相比,ZEA极显著抑制TM4细胞活性(P0.01),增加细胞凋亡率及提高ROS、SOD和MDA水平(P0.01),并能够显著增加Fas/FasL信号通路相关蛋白FasL、FADD、Cleaved-caspase8的表达水平(P0.05),极显著增加Fas的表达水平(P0.01);与ZEA组相比,ZEA+RSV组细胞活力显著提高(P0.05),细胞凋亡率和SOD水平显著降低(P0.05),ROS和MDA水平极显著下降(P0.01),Fas、FasL表达下调(P0.01和P0.05)。结果表明,RSV可有效减轻ZEA对小鼠睾丸支持细胞的氧化损伤作用,并能够通过调控Fas/FasL通路缓解ZEA诱导的睾丸支持细胞凋亡。  相似文献   

9.
为了研究黄芪总黄酮(TFA)的体外抗炎作用,通过脂多糖体外诱导小鼠RAW264.7细胞建立炎症模型,采用MTT法检测黄芪总黄酮的细胞毒性作用,用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α水平,采用Griess法检测细胞内NO表达水平。MTT结果显示,10~100μg/mL TFA对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。与模型组比较,10、25、100μg/mL TFA均能抑制RAW264.7细胞过量分泌IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α及NO,且呈一定的量效关系。本试验结果表明黄芪总黄酮具有体外抗炎活性。  相似文献   

10.
采用鸡枞菌多糖(TAP)体外作用于小鼠T淋巴细胞,用ELISA法检测其IL-4、IFN-γ及IL-2水平,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测相关细胞因子mRNA表达量,观察研究了鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响。结果表明,与ConA组相比,25~100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进T细胞产生IL-4、IFN-γ及IL-2(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的T细胞CD4+%(P<0.01),升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。提示,TAP对细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。  相似文献   

11.
鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。  相似文献   

12.
为探析猪流感病毒NS1蛋白中影响细胞定位和拮抗干扰素表达的关键氨基酸位点,本研究利用点突变技术扩增A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1突变基因,并构建重组表达质粒pCAGGS-NS1及突变体pCAGGS-NS1_(S42P)、pCAGGS-NS1D_(92E)、pCAGGS-NS1_(S42P/D92E)。将重组真核表达质粒转染细胞,SDS-PAGE和Western-blot均证实NS1蛋白及其突变体蛋白在A549和293T细胞中成功表达。间接免疫荧光试验表明,NS1及其突变体蛋白均主要分布在A549细胞核中,仅有少量分布于细胞浆。此外,试验证明另一株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株的NS1及其突变体蛋白也主要分布于细胞核中,说明点突变不影响SIV NS1蛋白的细胞定位。进一步利用荧光定量PCR和ELISA方法检测A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1点突变蛋白拮抗细胞中干扰素表达的影响,结果表明,pCAGGS-NS1_(S42P)转染组能够明显增强IFN-βmRNA、IFN-αmRNA转录水平(P0.01;0.01P0.05),但对TNF-αmRNA转录水平无明显影响(P0.05)。而pCAGGS-NS1D_(92E)和pCAGGS-NS1S_(42P/D92E_转染组细胞IFN-α、IFN-β和TNF-αmRNA转录水平均无明显变化(P0.05)。试验证实NS1蛋白第42位氨基酸对拮抗宿主细胞中IFN-α/β表达具有重要作用。  相似文献   

13.
探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Na?ve CD4~+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Na?ve CD4~+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。  相似文献   

14.
提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0~25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25~25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。  相似文献   

15.
为研究太子参茎叶多糖(Radix pseudostellariae stem and leaf polysaccharides,RPSLP)对小鼠脾淋巴细胞因子含量及对细胞因子和转录因子mRNA表达量的影响。将RPSLP添加到体外分离培养的淋巴细胞中,用ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α含量;RT-PC R法检测上述细胞因子以及转录因子T-bet、G ATA-3的mRNA表达量。检测结果表明,添加RPSLP后在3.125~50 g/m L浓度范围内可显著促进细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的分泌及其mRNA的表达(P0.05),并能调控T-bet、GATA-3的mRNA表达,使T-bet/GATA-3比率处于动态平衡。上述结果说明,RPSLP可以通过调控细胞因子mRNA表达来改变分泌量,对小鼠脾淋巴细胞起免疫调节作用。  相似文献   

16.
为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白nsp1对干扰素(IFN)激活的Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的影响,将PEDVnsp1蛋白表达质粒转染HeLa细胞,并用IFN-β处理,应用Western-blot对STAT1、STAT2磷酸化以及早幼粒细胞白血病蛋白(PML)表达水平进...  相似文献   

17.
为了探讨地衣芽孢杆菌对坏死性肠炎雏鸡回肠组织及细胞因子的影响,选用1日龄铁脚麻鸡120只,随机将其分为对照组、感染组、预防组(1g/kg菌粉Ⅰ),治疗组(0.5g/kg菌粉Ⅰ+4g/kg菌粉Ⅱ)。感染组、预防组、治疗组15日龄灌喂球虫,17~20日龄灌喂产气荚膜梭菌(1×108CFU/mL)1mL,对照组灌喂相同剂量生理盐水。采用Real-time PCR方法检测回肠组织中IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等4种细胞因子的表达水平,切片观察回肠组织变化。结果,产气荚膜梭菌的攻毒使雏鸡外周血白细胞及回肠组织细胞因子显著增加,回肠组织切片可见明显病变。地衣芽孢杆菌的补充减少了肠道病变及外周血白细胞数量。此外,与感染组相比,治疗组IFN-γ、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低,而预防组仅IL-1β显著低于感染组,其他细胞因子的表达无差异。结果表明,地衣芽孢杆菌对试验性雏鸡坏死性肠炎的防治具有促进作用。  相似文献   

18.
穿心莲内酯是从穿心莲中提取的主要药效成分,具有明显的抗炎作用。本试验旨在研究穿心莲内酯抗LPS诱发的小鼠乳腺炎的信号转导机制。选取36只分娩后第5~7天的初产、泌乳母鼠,随机将其分为6组,用LPS灌注乳池,建立小鼠乳腺炎模型。分别以不同质量浓度的穿心莲内酯(2.5、5、10 mg/kg)及地塞米松(5 mg/kg)经腹腔注射给药后第24小时,采取乳腺组织。通过组织切片观察乳腺组织的病理变化;分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR(qRT-PCR)测定促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的质量浓度及其mRNA表达水平;采用蛋白免疫印迹(Western-blot)测定NF-κB、p38、ERK和JNK的蛋白表达水平。结果显示,与LPS组相比,穿心莲内酯能减轻乳腺组织的病理损伤,抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,并呈现剂量依赖性;同时,穿心莲内酯抑制了转录因子p65的入核表达水平和Iκ-B、JNK、ERK1/2、p38的磷酸化水平。上述试验结果表明,穿心莲内酯通过抑制NF-κB和MAPKs信号转导通路,进而抑制促炎细胞因子的产生及其mRNA表达,最终发挥抗炎作用。  相似文献   

19.
研究在日粮中添加不同水平甘草多糖(GCP)对肉鸡免疫功能的影响。选用320只1日龄AA肉鸡,随机分成5组,每组4个重复,每个重复16只。对照组饲喂基础日粮,其他4组分别饲喂添加甘草多糖 200、500、1 000和1 500 mg/kg的试验日粮。在21和42日龄时,从每个重复随机抽取4只接近平均体质量的肉鸡,空腹称重,翅静脉采血制备血清,测定血清IgM、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-6的质量浓度和新城疫抗体水平;然后处死,摘取免疫器官脾、胸腺、法氏囊并称重,测定免疫器官指数;最后剪取小块脾,用来测定IL-2、IFN-γ、IL-1β mRNA相对表达量。结果显示:500 mg/kg组和1 000 mg/kg组的GCP可以显著提高21日龄时肉鸡脾、胸腺和法氏囊指数(P0.05),1 000 mg/kg组和1500 mg/kg组均能显著提高42日龄时肉鸡脾指数(P0.05);添加GCP能显著提高21日龄时肉鸡血清中IgM、IL-6、IFN-γ的质量浓度和新城疫抗体水平(P0.05),并能显著提高42日龄时肉鸡血清中IgM、IL-6和IL-2的质量浓度(P0.05),其中500 mg/kg组和1 000 mg/kg组GCP血清免疫球蛋白和细胞因子质量浓度较高;GCP能显著提高脾IL-2基因mRNA表达水平和21日龄时脾IFN-γ 基因mRNA表达水平(P0.05)。结论:在日粮中添加GCP可在一定程度上提高肉鸡的免疫器官指数、新城疫抗体水平、免疫球蛋白、细胞因子和脾相关细胞因子的基因表达水平,提高机体免疫功能。  相似文献   

20.
通过给小鼠腹腔注射100mg/kg环磷酰胺,建立免疫抑制模型,观察了100、200、400mg/kg剂量蕨麻多糖配合应用后对小鼠血清中细胞因子IL-6、IFN-γ和TNF-α水平的影响。结果表明,蕨麻多糖能明显升高正常小鼠血清中的IL-6水平,呈剂量依赖关系;能升高正常小鼠血清中的IFN-γ水平,而对TNF-α水平无明显影响。环磷酰胺能降低小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α水平,蕨麻多糖能拮抗环磷酰胺的免疫抑制,升高小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α水平,提高机体的免疫功能。  相似文献   

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