美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

CSFV、PRRSV、PEDV和PRV四重荧光定量PCR方法的建立及应用

为了快捷地进行规模化猪场疫病风险评估,建立了一种同时检测猪场环境中猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的荧光定量PCR方法。根据CSFV 5′UTR基因、PRRSV Nsp2基因、PEDV M基因和PRV g E基因保守区,设计特异性引物和探针,通过优化PCR反应条件,建立了四重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可特异性扩增CSFV、PRRSV、PEDV和PRV,与TGEV、RV、PCV2、PPV、PRV Bartha-K61、JEV、E.coli、S.suis 2等病原体无交叉反应,四种病毒的最低检出值为4.62×10¹copies/μL,批内及批间变异系数为0.003～0.016。与国标方法相比,两种方法阳性符合率为83.33%～100.00%(182份组织样品)。运用该方法检测猪场采集的434份肛拭子、鼻拭子及环境样品,肛拭子和环境样品中PEDV检出率较高,分别为16.53%和11.90%;环境样品中PRV检出率较高,为8.28%。综上结果,此方法为规模化猪场进行疫病风险评估提供...     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏检测鸡毒支原体(MG)的方法,本研究根据GenBank中登录的MK984197.1,针对PAPV基因的保守序列设计了1对特异性引物探针,将PCR扩增后的PAPV基因克隆至pMD19-T载体,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒标准品,建立鸡毒支原体TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性等进行优化与验证。结果显示,C_t值与标准模板在0.53×10⁸～0.53×10³copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.998,线性方程的斜率为-3.219,最低检测限度为0.53×10²copies/μL;经组内和组间重复试验,两者变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性;与鸡滑液囊支原体(MS)、火鸡支原体(MM)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用所建立的MG-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对部分地区抽检的60份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。上述结果表...     

鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的 TaqMan 探针荧光定量 PCR 检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的 B646L、EP402R、MGF360- 13L 基因序列,分别设计 PCR 引物和 TaqMan 探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验与临床样品检测,建立三重 TaqMan 探针荧光定量PCR 检测方法。 结果显示,以 B646L、EP402R 和 MGF360- 13L 重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R²)分别为 0.995、0.997 和 0.997;建立的方法与多种猪常见病原不存在交叉反应,特异性良好;对 B646L、MGF 360- 13L 与 EP402R 基因的检测下限均为 10 copies/ μL,变异系数均<2%,该方法灵敏度高;当临床样品稀释至 10^{- 5}时,即滴度为 10^2.5TCID₅₀/ m L 时仍能检测到病毒粒子,具有较高的临床使用价值。 本研究建立了一种高效、灵敏、特异的 ASF...     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

鉴别检测野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒多重荧光定量PCR方法的建立

为建立一种鉴别检测野生型和基因缺失株非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测P72、CD2v、MGF360-14L基因的多重荧光定量PCR方法.该方法与伪狂犬病病毒(PRV)、...     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

鸡传染性喉气管炎TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的快速诊断方法,基于ILTV g B基因设计特异性探针和引物,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,ILTV qPCR方法的标准曲线为y=-3.892 9x+44.607,线性相关值(R²)为0.998 8。该方法的最低检测限为1.0×10 copies/μL,批内与批间重复性检测的变异系数均小于5.64%,且与其他鸡源病原体无交叉反应。临床样本检测结果显示,该qPCR方法的检测阳性率为98.7%,而普通PCR的检测阳性率为92.61%。以上结果表明,该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ILTV的疫病监测和流行病学调查,为ILTV感染的预防和诊断提供了有力工具。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数（R2）均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MW)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MW的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×100 copies/μ...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6 (M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法.结果 显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好...     

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量 PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%.表明,此方法具有良好的准确性和重现性.     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。