印第安纳型水疱性口炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据印第安纳型水疱性口炎病毒(VSV)L蛋白的序列,设计了一套特异性引物,建立了检测VSV核酸的一步法RT-PCR方法,并用该法检测了不同的组织样品。结果显示,人工感染VSV小鼠组织检测为阳性,而口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、猪生殖与呼吸综合征等病料检测均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。     

一种制备复制缺陷型重组水疱性口炎病毒新方法的建立

为了提高复制缺陷型重组水疱性口炎病毒(VSV△G*G)的制备效率,对传统制备方法进行了改良,在制备过程中先用VSV△G*G转导细胞1h后,再对其进行转染,24h后收集细胞上清并进行毒价测定。并与用传统方法制备的重组病毒的毒价进行比较,结果表明,用改良方法与传统方法制备的重组病毒具有相同的毒价,但改良方法比传统方法节省了20～48h,同时减少了表达的G蛋白诱导细胞融合所造成的细胞损伤。表明改良方法能够代替传统方法制备出高毒价的复制缺陷型重组病毒。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因主要抗原表位区在大肠埃希氏菌中的高效表达及纯化

利用PCR技术扩增编码水疱性口炎病毒印第安纳型(VSV-Ind)糖蛋白基因的主要抗原表位区,通过引入其两端的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,定向插入到pET30c质粒T7启动子下游的多克隆区,构建重组质粒pET30c-vsvG,并转化至宿主菌BL21(DE3)株中。用1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳表明,重组蛋白在大肠埃希氏菌中得到了高效表达,经过4 h表达即可达到高峰;融合蛋白的相对分子质量为57 ku。重组蛋白含有六聚组氨酸尾,主要以包涵体形式存在,Ni柱纯化后的蛋白经Western-blotting鉴定,具有良好的抗原性和特异性。     

表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

为了构建携带e GFP标签并表达马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)囊膜糖蛋白(GP)的复制型水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis v,iVrSuVs)假型病毒,通过将VSV感染性克隆全长质粒中的G基因替换成马尔堡病毒的GP基因,与4个辅助质粒p3.1-VSV-N、p3.1-VSV-P、p3.1-VSV-L、p3.1-VSV-G共转染BSR细胞,拯救成功的重组VSV病毒传5代后,进行Western-blot、间接免疫荧光试验、RT-PCR鉴定和生长动力学曲线检测。显微镜检测结果显示,3个重组全长质粒分别与4个辅助质粒共转染BSR细胞培养48 h后均能使细胞发生合胞体病变并伴有绿色荧光蛋白表达;Western-blot、间接免疫荧光试验鉴定结果显示,3株马尔堡病毒的囊膜糖蛋白在重组VSV病毒中正确表达;生长动力学曲线显示,3株重组VSV病毒的毒力相较于母本VSV病毒均降低,但病毒滴度依旧能达到1×10⁶～1×10⁷TCID₅₀mL^-1。结论：本研究成功构建3株携带e ...     

印第安纳型水泡性口炎病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

利用ESE-Quant tube scanner监测平台,建立了一种基于实时荧光RT-LAMP技术的印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)快速检测方法.根据VSV-IN的G基因序列,设计6条特异性引物,在63℃条件下,进行核酸扩增,反应时间为45 min.在扩增前加入SYBR Green I染料作为反应的指示剂,以S...     

水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建立

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到N基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,N基因与参考序列同源性高达 99%。同时根据克隆产物进行亚克隆 ,建立了VSV的PCR检测方法。     

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测水泡性口炎病毒方法的建立

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法.通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-N...