新城疫病毒Mukteswar毒株反向遗传系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入T7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVT7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVT7按一定比例混合共转染BRS-T7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡痘病毒282F_4弱毒株基因组BamHⅠ片段的克隆与分析

采用鸟枪法克隆鸡痘病毒（Ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ，ＦＰＶ）基因组ＢａｍＨⅠ部分片段，用Ｔｈｇｏｘｉｇｅｎｉｎ一ｄＵＴＰ标记的ＦＰＶ２８２Ｆ_４弱毒株ＢａｍＨⅠ片段探针，点杂交，证实２２个克隆插入了ＦＰＶ２８２Ｅ_４弱毒抹ＤＮＡ的ＢａｍＨⅠ片段，选取具有代表性的大小不同的６个质粒ｐＵＡ、ｎＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＥ、ｐＵＦ。６个质粒插入的片段Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ分别为７．３，４．９．４．２，３．６，３．２，３．０ｋｂ，分别以ＣｌａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄⅡ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ、ＳａｃⅠ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ进行单酶切，又经适当组合酶切。实验结果表明，在各片段在在的单酶切位点为Ａ：ＥｃｏＲⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｈⅠ位点；Ｂ：ＥｃｏＲⅠ、ＸｈⅠ、ＨｉｎｄⅡ位点；Ｃ：ＣｌａⅠ、ＳａｃⅠ、ＳａｌⅠ位点；Ｄ：ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ位点；Ｅ：ＥｃｏＲＶ位点；Ｆ：ＥｃｏＲＶ位点。逃出７．３ｋｂ片段，选取片段中单一酶切位点ＢｇｌⅡ，插入痘苗病毒（ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ，ｖｖ）Ｐ_７，５启动于和Ｐ_１１启动子控制下的报告基因ＬａｃＺ，构建成时时表达载体质粒，通过与ＦＰＶ２８２Ｅ_４株转染鸡胚成纤维细胞，一生的重组病毒，可以表     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

反向表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒Bartha-K61株的构建

为构建以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株为载体的反向表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(rgp)的重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为反向连接,阳性重组子命名为p8AA-EGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/EGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的效价(TCID50)为108.25/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性.     

H3N8亚型马流感病毒拯救体系的建立

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株的EIV rH3N8,生物学试验结果表明,rH3N8在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致.以猪流感病毒(SIV)A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)内部基因的重组阳性质粒替换rH3N8的相应基因,成功拯救出重组病毒rgH3N8.两拯救毒株经鸡胚一次传代的血凝效价分别为1:32、1:64,最高可达1:1 024、1:2 048;接种MDCK细胞54 h后的血凝效价最高均可达1:512.rH3N8亚型EIV的成功拯救及基因的成功替换,为流感病毒突破种闻屏障分子机制的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础.     

H3N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Heilongjiang/1/2005(H3N2)的反向遗传操作技术平台,利用RT-PCR扩增了H3N2亚型猪流感病毒的8个基因片段,分别连接到pBD双向转录表达载体上。将8个重组质粒纯化后,共转染293T细胞,48h后收集上清,接种MDCK细胞。当MDCK细胞呈现明显病变时,收集上清,做血凝试验,检测出有血凝现象。通过MDCK细胞病变情况、生长曲线、空斑形态等验证拯救病毒的可靠性,结果发现:野生毒株和拯救毒株在MDCK细胞上引起的病变情况基本一致,生长曲线的测定结果没有明显差异,空斑形态也极其相似。H3N2亚型猪流感病毒的成功拯救为猪流感病毒的致病机理、传播机制、基因功能研究以及疫苗研发奠定了基础。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒(MDPV)强毒Q株经番鸭胚连续传代,获得致弱株MDPV-26.根据已发表的MDPV的全基因序列,设计了1对引物LHMP7/LHMP8,同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶SacⅡ和KpnⅠ的酶切位点.应用PCR技术扩增了MDPV-26株的VP2基因片段.将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定.测序结果表明,弱毒株MDPV-26与强毒株MDPV-Q的VP2基因序列相同率达99.7%,与国外分离株的同源性为98.3%,说明强、弱毒株的VP2基因序列变化不大.     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

牛IgG2 Fc受体在COS-7细胞表面的稳定表达

将牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)编码区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pc3bo2R;以重组质粒转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验检测boFcγ2R在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和连续克隆化,在转染细胞表面稳定表达了boFcγ2R受体分子,转染细胞的玫瑰花环形成率达90%。最后获得稳定表达boFcγ2R受体分子的COS-7转染细胞系,为受体的功能研究提供了良好的技术平台。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆

根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GSWW分离株的全长基因组序列信息,采用合成生物学的方法,将全长基因组序列分为两段(7 636 bp和7 774 bp)分别连接到低拷贝载体p BR-322载体中,然后将2个半长片段相连接得到全长c DNA克隆。将质粒线性化后,体外转录获得全长RNA,经电穿孔转染BHK21细胞拯救获得了初代病毒。将初代病毒接种感染Marc-145细胞进行传代,接毒后第36小时即可观察到完全的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证,证明成功获得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒与原田间分离毒的复制能力,没有显著差异,采用实时荧光定量法测得的拯救病毒复制的最高效价为1×1010copies/m L。本研究表明,采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建,方法可行且速度快,为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。     

新城疫病毒La Sota疫苗株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

为构建能为新城疫病毒拯救提供直接使用的全长cDNA克隆,利用分子克隆的方法,将新城疫病毒La Sota株全基因组分成末端部分重叠的11个片段(F1～F11),按其基因组顺序克隆至改造后的真核表达载体pVAXr上,同时在全长cDNA两侧引入T7启动子和丁型肝炎病毒核酶(Rib)序列,以确保病毒基因组转录产物的两端形成精确的核酸序列。鉴定结果表明,新城疫病毒La Sota株基因组全长cDNA已成功克隆至pVAXr上,命名为pVAXr-FL。本研究为新城疫病毒的拯救及外源基因的表达奠定了基础。     

野鸭源新城疫病毒V蛋白抑制宿主细胞干扰素β产生的机制研究

为研究野鸭源新城疫病毒(ND V)V蛋白抑制宿主细胞干扰素β(IFN-β)产生的机制,构建真核表达新城疫病毒强、弱毒株V蛋白的重组载体,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-Luc报告质粒共转染H EK-293T细胞,接种仙台病毒刺激宿主细胞后,测定宿主细胞的相对荧光素酶活性。结果显示,新城疫病毒强毒株V蛋白(vNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1、PRDⅢ/Ⅰ启动子活性,新城疫病毒弱毒株V蛋白(aNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1启动子活性,进而抑制IFN-β的产生。构建新城疫强弱病毒V蛋白嵌合体进行试验,结果表明NDV强毒株V蛋白羧基端在抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子活性中发挥关键作用。研究结果为深入研究V蛋白对抗宿主细胞天然免疫机制奠定了基础。     

ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP重组蛋白的表达及广谱性NDV单克隆抗体的制备

为了制备针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株中扩增出NP基因,并定向克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体中,经酶切鉴定及测序验证后转化BL21(DE3)进行原核表达,用纯化得到的NP重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠。结果显示,成功表达出分子质量约为71ku的NP重组融合蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白以可溶性形式存在于菌体中。用间接ELISA方法成功筛选出2株针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好的ELISA、IFA以及Western-blot效价。免疫特异性鉴定结果表明,获得的2株单克隆抗体具有良好的通用性,无论是ClassⅠ毒株还是两种不同基因组长度的ClassⅡ毒株,均能与其发生特异反应。