猪链球菌2型动物致病性试验研究

选取猪链球菌2型SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7和SS2-N(国外引进)株,对BALB/c小鼠、猪、兔及普通小白鼠致病性进行试验.结果SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠半数致死量(LD50)分别为2.1×106、3.1×107、5.3×107和9.4×107,SS2-N株以2.8×108活菌对BALB/c小鼠不能致病;SS2-1株对猪LD50为4.2×107,对猪半数感染量(ID50)为1.33×106,用8.0×108活菌对兔及普通小白鼠感染均不能致病.提示猪链球菌2型人工感染可引起BALB/c小鼠和猪发病;其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)的表现型与对BALB/c小鼠的致病性无相关关系;BALB/c小鼠可用于猪链球菌(2型)病疫苗免疫试验的动物模型.     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A~G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。     

猪链球菌2型的致病特性与毒力因子

介绍了猪链球菌2型对猪、人、其他动物及实验动物的致病特性;概述了猪链球菌溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素、荚膜多糖、44kb蛋白和IgG结合蛋白及纤毛、粘着素等毒力因子的研究概况.     

猪链球菌2型SS2-1和SS2-H株的培养稳定性检测

将猪链球菌 2型制苗候选菌株SS2 1和SS2 H在血平板上连续传代至第 41代 ,并分别检测第 1代、第 11代、第2 1代、第 3 1代和第 41代菌株的菌落及细菌形态、生化特性、溶菌酶释放蛋白 (MRP)和胞外因子 (EF)等指标。结果 ,从第1代至第 41代 ,2株细菌的菌落及细菌形态、生化特性、MRP和EF均没有发生变异。这表明SS2 1和SS2 H菌株培养稳定性较好 ,使用限定代次至少可达 41代 ,可作为理想的疫苗生产菌株     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌 2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为 14 96bp目的片段的引物 ,建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌 2型参考株SS2 N株的检测结果为阳性 ,对马链球菌兽疫亚种 (C群 )参考株ATCC3 5 2 46、分离株SESZ Y、SESZ T、SESZ C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏菌的检测结果均为阴性 ;用EcoRⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期结果一致的 863bp和 63 3bp的 2个片段。经对SS2 1株的PCR产物进行测序及序列分析 ,表明其与 193 3株、P1/ 7株的核苷酸同源性分别为 99.7%和 10 0 %。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

肺泡巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。     

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段.利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp.将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达.SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku.Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别.免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原.     

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型(SS2)毒力因子的特异性检测方法,研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行了分析.将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,以纯化的MRP蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP McAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3.经用间接ELISA方法测定,单抗腹水的抗体效价均超过1105,杂交瘤细胞培养上清液的效价为1128～11 024.western-blotting鉴定结果表明,6株单抗均具有特异的生物学活性;以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP.     

溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性

比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体 ,且和其他毒力因子之间存在协同作用     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

牛源大肠杆菌毒力基因的检测及其对小鼠致病性的研究

为了解肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7黑龙江分离株的毒力及其接种小鼠后所引起的病理组织学变化,对该菌株进行了7种毒力基因的检测和毒力试验;在5周龄昆明小鼠饮水中加入萘啶酮酸预处理,腹腔注射大肠杆菌O157∶H7 1.0×1010 CFU,进行临床观察与病理组织学检查。结果显示,该菌株携带stx1、eaeA及hly基因,未检测出stx2、F4、k99、F17基因;小鼠接种该菌株后24h内全部死亡,半数致死量为7.9×107 CFU,最小致死量为5.0×106CFU。该分离株引起肺出血、肾水肿、肠壁变薄等病理变化。研究结果表明,EHEC O157∶H7黑龙江分离株毒力较强,可引发小鼠器官与肠道出现不同程度的病理变化;这一结果有助于了解大肠杆菌O157∶H7的致病机理和临床诊断。     

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性.结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶茵酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10).证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有剐于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2.表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力.     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

禽致病性大肠杆菌强毒力岛摄铁功能与致病性关系的研究

采用PCR法检测强毒力岛主要结构基因irp1、irp2、fyuA在禽致病性大肠杆菌中的分布;铬苯胺醇法检测铁载体的合成;SDS-PAGE法检测耶尔森菌摄铁蛋白HMWP1和HMWP2的表达,以半数致死量试验测定禽致病性大肠杆菌致病性与强毒力岛摄铁功能的关系。结果表明,7株禽致病性大肠杆菌强毒力岛irp1、irp2和fyuA基因的检出率为100%;铬苯胺醇平板上都能产生橙色透明晕圈;缺铁条件下,能够表达与耶尔森菌相同的摄铁蛋白HMWP1和HMWP2且半数致死量试验验证禽致病性大肠杆菌的毒力与强毒力岛摄铁功能呈正相关。证实禽致病性大肠杆菌中强毒力岛的摄铁功能与其致病性有密切的联系。     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

猪链球菌2型胞外因子短片段的原核表达及其免疫保护力

以江苏分离株HA9801基因组DNA为模板,扩增猪链球菌2型(SS2)胞外因子ef基因的1423～2203 bp片段,并将其亚克隆至表达栽体pGEX-4T-1上,构建了重组质粒pGEX-4T-1-ef.将鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导8 h,表达的融合蛋白rGST-sEF大小为56 ku,以包涵体形式存在.Western-blotting显示,rGST-sEF能与全菌兔抗血清发生特异性反应.用自制rGST-sEF亚单位疫苗免疫新西兰兔.以最小致死量HA9801攻击,保护率为60%.结果表明,表达的融合蛋白rGST-sEF具有良好的免疫原性和免疫反应性.     

四川省猪链球菌病的流行病学调查

2005年7月,在四川省资阳、内江等地相继发现一种以发病急、高热、伴有头痛等全身性中毒症状,严重者出现中毒性休克、脑膜炎为主要临床表现的病例。几乎所有病例与病死猪有关。在1个月内,共报告人感染204例,其中死亡38例,分布在以资阳、内江为主的12个市37个县。经确诊系由猪链球菌2型引起。在此期间,猪发病死亡647头,分布在8个市21个县。