应用Dot-ELISA检测肉品中沙门氏菌

(一)材料与方法1.载体:硝酸纤维素膜(2×8cm),浙江黄岩四青生化材料厂产品。2.沙门氏菌多价抗血清:成都生物制品研究所产品,重庆肉联厂提供。3.参考菌株:沙门氏菌(A～F群),重庆肉联厂提供;金色葡萄球菌(1800株)、猪丹毒杆     

猪胴体分离出海因德马什沙门氏菌

1986年7月,我们在某肉品加工公司抽检来自青岛的商品猪胴体282头份,检出沙门氏菌16株,其中有1株海因德马什沙门氏菌(S. Hindmarsh),在国内未有报道。 培养特性 有动力。在胆硫乳琼脂(DHL)平板上菌落呈圆形、中等大小、湿润光滑、边缘整齐,半透明。在普通培养基上生长良好。在氰化钾培养基上不生长。     

肠道微环境重组技术对提高家禽抗病力的研究─—乳杆菌XF－9301体外拮抗试验

从健康成年母鸡肠道中分得乳杆菌若干株，选典型的一株（ＸＦ－９３０１）在试管内进行了对鸡白痢沙门氏菌的体外拮抗试验。结果表明，此株乳杆菌对鸡白痢沙门氏菌在体外有极强的拮抗作用，共同培养９小时内，即可完全抑制其生长繁殖。     

鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建

为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。     

鸡源致病性沙门氏菌新近分离株的耐药性与耐药基因

为了了解河南省鸡源沙门氏菌新近分离株的药物敏感性和耐药基因的存在情况,为进一步研究细菌耐药的分子机制和新型抗菌药物的研制提供资料,利用K-B法检测了98株鸡源沙门氏菌对22种药物的敏感性,采用PCR方法检测了13种常见耐药基因在分离株中的分布情况。结果显示,所有菌株对红霉素、青霉素、阿齐霉素和氨苄西林的耐药率均在60%～100%之间。三重以上耐药的菌株高达96.94%,七重以上耐药的菌株为56.12%,耐药最多的菌株可耐受18种抗生素。从13种常见耐药基因中扩增到3种四环素类、2种氨基糖苷类、2种β-内酰胺类、1种氯霉素类和3种磺胺类耐药基因。研究表明,沙门氏菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。     

奶牛副伤寒免疫防治的研究

用从奶牛副伤寒疫区分离到的鼠伤寒沙门氏菌株配以标准菌株，制各鼠伤寒沙门氏茵菌笛，在疫区给临产母牛和青年育成牛免疫接种。共免疫牛１０５０头，均无不良反应。通过攻毒保护试验，接种菌苗的犊牛可抵抗３００亿强毒活菌的攻击，免疫牛血清中抗鼠伤寒沙门氏菌抗体的效价达１：２５６．同时，利用自制的抗鼠伤寒沙门氏菌高免血清对未进行免疫接种的一进行紧急预防和治疗，效果显著。由此表明，利用当地菌株制备菌苗，可有效地预防奶牛副伤寒的发生。     

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

鹧鸪猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

1999年6月,某饲养场9日龄鹧鸪发生大批死亡,临床表现为不食、呆立、羽毛松乱、腹泻;病理变化主要表现为肝呈土黄色、出血、并有坏死灶.从肝、脾分离出4株猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis),均有较强的致病性.