牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

采集内蒙古地区疑似发生牛传染性鼻气管炎的发病牛的鼻拭子液,经MDBK细胞连续传代培养,分离获得1株病毒,该病毒在MDBK细胞上增殖致细胞病变。经PCR鉴定、间接免疫荧光试验和动物回归试验,证明该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),对牛具有较强的致病性,将其命名为IBRV NM8株。通过PCR扩增分别获得gB和gE全基因序列,遗传进化分析表明,IBRV NM8株g B和g E基因与BHV-1型参考毒株的同源性较高,位于同一进化分支,而与BHV-5型参考毒株位于不同的进化分支。NM8株gB基因与Cooper株、MN12株、Los Angeles株和NM06株等的亲缘关系相对较近,而g E基因与瑞典的Salwa株的亲缘关系较近,位于同一分支。上述研究结果将为我国IBRV流行病学研究提供新的数据,并为相关后续研究奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎弱毒活疫苗的安全性和免疫保护效果

为评价牛传染性鼻气管炎弱毒株的安全性及其免疫保护效果,将牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)驯化培养,接种MDBK细胞,优化病毒增殖条件,并将其免疫牛,评价其安全性及免疫保护效果。结果显示,优化后的病毒效价可达109.0 TCID50/mL。动物试验结果显示,3月龄牛接种该弱毒株后,体温正常,无任何临床异常表现。对免疫牛进行的攻毒试验结果显示,此弱毒株对牛的免疫保护效果良好。上述结果表明,该毒株可以作为研制弱毒活疫苗的候选毒株。     

口疮病毒XC13株的分离鉴定

采用MDBK细胞对西昌市某山羊场疑似患有口疮的山羊病料进行分离培养,经动物回归试验、PCR、遗传进化分析等对分离毒株进行鉴定。结果表明,病料在MDBK细胞上产生致细胞病变;接种病料的山羊出现典型的传染性脓疱;PCR从分离毒株中扩增出F1L基因片段,该基因片段序列与口疮病毒(ORFV)参考株FJ-SL2、FJ-SL1的核苷酸序列的同源性分别为99.8%、99.5%,亲缘关系较近,遗传进化分析处于同一分支上。本研究从疑似口疮病料中成功分离鉴定出1株口疮病毒,遂将其命名为ORFV XC13。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

牦牛传染性鼻气管炎病毒85-Y株回归本动物试验

1985年12月我们从病牦牛的眼、鼻分泌物中分离到一株有致细胞病变能力的病毒,经血清学鉴定,初步认定为牛传染性鼻气管炎(IBR)病毒,并定名为85-Y毒株。为明确IBR病毒85-Y毒株对牦牛的致病性,进行了回归本动物试验。 材料与方法 (一)细胞 按常规方法制备犊牛肾(BK)继代细胞供种毒传代、毒价测定、病毒回收与鉴定。 (二)种毒 取85-Y毒株第6代冻干毒(-20℃下保存150天,毒价10~5TCID_(50)/ml)按常规方法在BK细胞上连续传4代作为种毒,经-20℃～37℃冻融3次后用于接种牦牛,同     

牦牛IBR病毒的分离与鉴定

牛传染性鼻气管炎(IBR)是牛的急性发热性呼吸道接触传染病。1956年首次在美国分离到本病病原——牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),后来分类为牛疱疹病毒1型,此病广泛分布于世界各国。1980年4月我国第一次从新西兰进口奶牛体内分离到IBR病毒,以后又陆续从进口的奶牛、黄牛、水牛以及种公牛的冷冻精液中分离到该病毒。封启民等人对我国部分省区进行的血清学普查结果表明:广东、广西、河南、河北、新疆、山东及四川等地的黑白     

牛传染性鼻气管炎病毒LA株DNA的分子克隆

本实验用鸟枪法和选择法将牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的LA株DNA克隆到载体质粒pBR325,pBR322或pUC_9的HindⅢ位点中。经用光生物素标记的IBR DNA和牛胸腺细胞DNA与各重组质粒杂交筛选后,共得到10个病毒DNA的HindⅢ片段,分别是A,B,C,E,G,I,J,K,L和M,克隆的DNA占全病毒DNA的89.5％。     

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系(MDBK)培养牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该ELISA的判定标准为:血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好。与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

牛传染性鼻气管炎灭活疫苗的安全性和免疫保护效果

将牛传染性鼻气管炎病毒分离株LN01/08株经BEI灭活,与206佐剂混合乳化制成牛传染性鼻气管炎灭活疫苗,对制备的灭活疫苗进行了安全性和免疫保护效果研究。将该疫苗分别接种1月龄犊牛、6～8月龄牛、后备母牛及不同怀孕阶段母牛,接种剂量为4mL(2头份),检验疫苗的安全性;将疫苗接种6～8月龄牛,接种剂量为2mL(1头份),首免后第21天进行二免,二免后第21天用强毒进行攻击,检验疫苗的保护效力。结果显示,不同月龄的牛及不同怀孕阶段的母牛接种疫苗后体温正常,无任何临床异常表现;怀孕牛无流产、产死胎及木乃伊胎现象。疫苗接种牛对强毒攻击的保护率达80%以上。研究表明,该疫苗对牛安全,且免疫保护效果良好。     

牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测

将无血清细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗原包被于硝酸纤维素膜,加入待检血清样品后,利用纳米胶体金标记的山羊抗牛IgG显色,建立了检测IBR抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸盒。整个试验过程仅需5min即可判断结果,与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻黏膜病、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测,结果二者的阳性符合率达94.4%。结果表明,该法具有特异、敏感、快速可靠、效果直观、结果容易判断的特点,非常适用于IBR的早期诊断和流行病学调查。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猫源弓形虫虫株的分离与鉴定

将猫的心、脑、舌用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠,经连续传代分离弓形虫虫株,用特异PCR方法对所分离的虫株进行了鉴定。分别从24只猫的样品中分离出8株弓形虫虫株,用弓形虫种特异的PCR方法对8个虫株进行鉴定,均得到弓形虫的特异条带;测序证明所扩增出的DNA片段确为弓形虫的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS-1)部分序列。研究结果表明,将动物组织用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法,特异PCR方法能准确、快速地鉴定弓形虫虫株。     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。