幼龄绵羊血清T4含量的季节和昼夜周期变化

幼龄绵羊血清甲状腺素 (T4)含量的放射免疫测定 (RIA )表明 ,幼龄绵羊年平均含量为 5 8.10 6ng/mL±11.0 5 4ng/mL ,其中冬季昼夜平均含量最高为 72 .5 94ng/mL± 5 .0 48ng/mL ,极明显地高于其他季节 ;春季为 60 .171ng/mL± 8.0 11ng/mL ,极明显地高于夏季均值 47.0 5 5ng/mL± 1.5 41ng/mL(P <0 .0 1) ;秋季为 5 2 .60 2ng/mL± 2 .896ng/mL,与夏季无明显差异 (P >0 .0 5 )。测定结果还表明 ,昼夜周期性变化无明显的差异 (P >0 .0 5 ) ,但白天小绵羊血清中T4含量高于夜晚。     

马急性滑膜炎模型关节液中MMP-2和MMP-9质量浓度变化的研究

为探索基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在马急性滑膜炎模型中的作用,选用13匹蒙古马,将其随机分为试验组(n=8)和对照组(n=5)。在试验组马右侧腕关节内注入0.5ng/mL大肠杆菌脂多糖1mL,建立马滑膜炎模型;在对照组马右侧腕关节注射1mL磷酸盐缓冲液。注射后第0、8、24和168小时各采集关节液1次,用ELISA检测马关节液中MMP-2和MMP-9的质量浓度。结果显示,试验组马在注射后第8小时关节液中MMP-2、MMP-9质量浓度显著增加并达到最高,分别为18.05ng/mL±0.49ng/mL和19.64ng/mL±0.59ng/mL,与对照组比较差异显著。注射后第24小时MMP-2、MMP-9质量浓度下降,第168小时质量浓度恢复到对照组水平。结果表明,MMP-2和MMP-9在滑膜炎的急性期起到重要作用;MMP-2和MMP-9可以作为检测马滑膜炎的指标。     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞(PGCs)传代培养的影响,将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养,即A组:基础液+10 ng/mL白血病抑制因子(LIF)+10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);B组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF;C组:基础液+20 ng/mLLIF+10 ng/mL bFGF;D组:基础液+20 ng/mL LIF;E组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF+20ng/mL干细胞因子(SCF);F组:基础液+20 ng/mL LIF+40 ng/mL bFGF+40 ng/mL SCF;G组(对照组):基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞(BEF)饲养层上进行传代培养。结果,原代时,A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组(P<0.05),其中E和F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05),而与B、C、D组差异均不显著(P>0.05);1~8代时,B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05);对照组传代数仅为2代,A组为5代,而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明,在传代过程中,LIF起主要作用,20 ng/mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

猪SIgA直接ELISA检测方法的建立及应用

采集猪肠黏液并分离纯化出猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA),制备兔抗猪SIgA IgG抗体,经HRP标记,并优化直接ELISA检测猪SIgA的条件,建立了检测猪SIgA的直接ELISA方法。结果显示,筛选的最佳反应条件:黏液蛋白包被浓度为10μg/mL,兔抗猪SIgA IgG-HRP酶标抗体的工作浓度为1∶200,反应时间为60min。包被SIgA浓度标准曲线的线性范围为90～1 400ng/mL,回收率为85.85%～133.88%,变异系数为13.12%～17.67%。采用该方法对猪肺炎支原体灭活疫苗免疫与攻毒后的仔猪肺冲洗液和肠黏液中的SIgA进行检测;结果显示,攻毒后免疫猪肺冲洗液中SIgA含量平均为205.81ng/mL,显著高于攻毒对照猪的147.56ng/mL和空白对照猪的124.37ng/mL(P<0.05);免疫猪肠黏液中SIgA含量平均为67.94ng/mL,与对照猪无明显差异。结果证实,建立的猪SIgA直接ELISA方法具有经济、适用和准确的特点。     

低聚果糖诱导的马急性蹄叶炎模型中三种相关酶质量浓度的变化

为探讨基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和集硅酶-1在低聚果糖诱导的马急性蹄叶炎中发挥的作用,将24匹蒙古马随机分为试验组和对照组,每组12匹。试验组灌服低聚果糖,从灌服后第0到72小时,每隔4h采集1次颈静脉血(5mL),3 000r/min离心10min后用ELISA检测血浆中MMP-1、MMP-9和集硅酶-1的质量浓度。结果显示,MMP-1、MMP-9和集硅酶-1的质量浓度分别在灌服后第24、28和48小时达到峰值,峰值分别为37.96ng/mL±4.91ng/mL、199.37ng/mL±25.39ng/mL和15.11ng/mL±1.50ng/mL,与对照组差异性显著(P0.05)。结果表明,MMP-1、MMP-9和集硅酶-1的质量浓度随时间发生较大变化,可能在急性蹄叶炎的发展过程中起到重要作用,其中MMP-9可能是关键的分子指标。     

猪血浆样品中三氮脒质量浓度的高效液相色谱测定方法的建立

用乙二胺四乙酸二钠溶液稀释猪血浆样品,用SEP-PAK-C18固相萃取小柱富集药物,再以含有离子对试剂的乙腈洗脱。以氮气吹干洗脱液,流动相复溶后测定药物的质量浓度。HPLC分析柱为BDS C18,流动相组成为V(乙腈)∶V(pH 3.2的0.005mol/L辛烷磺酸钠溶液)=30∶70,紫外检测波长372nm。猪血浆中三氮脒的质量浓度在0.01~40.0μg/mL范围内可准确定量;血浆中三氮脒的质量浓度为0.05、0.5、10μg/mL时,相对回收率≥89.09%,批间变异系数在0.81%~4.41%之间。猪血浆中三氮脒的定量限为5ng/mL,检测限为2ng/mL。结果表明,本研究建立的HPLC方法操作简单、重复性和灵敏度好,定量范围宽,适用于检测猪血浆样品中三氮脒的质量浓度。     

绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹浓度的RP-HPLC测定

利用C8色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以V(乙腈)∶V(15 mmol/L KH2PO4)缓冲液=39∶61为流动相,在320 nm紫外光下,利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹的浓度。结果显示,氟甲喹和7-羟基氟甲喹分别在20~10 000 ng/mL和20~500ng/mL范围内线性关系良好(r=0.999和r=0.998),平均绝对回收率分别为84.3%±6.7%和67.5%±5.6%,日内与日间精密度均小于8.3%,最低检测限均为10 ng/mL;内源性物质不干扰测定。表明,RP-HPLC的工作曲线稳定,灵敏度高,操作步骤简单,可用于绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹浓度的测定和药动学考察。     

绵羊血浆阿维菌素荧光高效液相色谱检测法的建立

建立了一种绵羊血浆中阿维菌素 (AVM )荧光高效液相色谱 (HPLC)检测法。用甲醇提取绵羊血浆中的AVM ,并用ODS C18固相萃取法进行纯化 ,纯化后的AVM经干燥处理后 ,用三氟乙酸酐和N 甲基咪唑对其进行荧光衍生化 ,用荧光HPLC进行检测。本方法的最低检测限为 0 .1ng/mL ,在血浆AVM含量 2 .5～ 5 0 .0ng/mL范围内 ,标准曲线方程为Y =2 72 12x -10 412 (r =0 .9995 ) ,样品的平均回收率为 92 .0 2 %± 6.3 3 %。批内变异系数 1.98%～ 6.2 2 % ,批间变异系数 2 .3 1%～ 8.94%。检测结果显示 ,本方法灵敏度高 ,干扰少 ,重复性好。     

神经生长因子对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a培养液(含 3 mmol/L L-谷氨酰胺、1 g/L BSA、29 ng/mL睾酮、2.5μg/mL转铁蛋白、100 ng/mL胰岛素和4 ng/mL硒),在96孔培养板中,每孔250μL培养液条件下,研究了神经生长因子(NGF)对牛腔前卵泡体外发育的影响。结果表明:在培养液中添加 3种不同浓度(4、6、8 IU/mL)NGF对体外培养的d<60μm腔前卵泡有促进生长的作用。在体外培养10 d时,3种不同浓度NGF组的d<60μm腔前卵泡及其卵母细胞直径平均增长值显著高于对照组,但对60μm130μm的腔前卵泡作用不显著。同时,不同浓度的 NGF显著提高了d<60μm腔前卵泡的发育率。     

磺胺甲(口恶)唑的控温相变免疫分析

将已制备的抗磺胺甲唑(SMX)单克隆抗体(AbSMX)与温度敏感水凝胶(pNIPA)偶联形成水凝胶复合物(pNIPA-AbSMX),用异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗原(FITC-AgSMX)和游离半抗原SMX竞争地与有限量的AbSMX和pNIPA-AbSMX反应,根据水凝胶相变温度以上免疫复合物沉淀的特性进行分离,结合抗原抗体免疫反应测定SMX,建立了一种检测SMX的控温相变免疫分析方法。结果表明,SMX浓度在0.1ng/mL~100μg/mL范围内有良好的线性关系,60%抑制率时灵敏度为0.03μg/mL。     

牛乳中三氮脒残留高效液相色谱检测方法的建立

以乙腈沉淀牛乳中的蛋白质,上清液采用Oasis WCX固相萃取小柱净化浓缩,用乙酸-甲醇溶液洗脱药物,研究了牛乳中三氮脒残留的高效液相色谱检测方法。洗脱液上机检测,紫外检测波长372nm,色谱分析柱为氰基柱,流动相为V(乙腈)∶V(甲酸铵溶液)=10∶90,等度洗脱。当样品中三氮脒的含量为0.010～1.00μg/mL时,药物质量浓度与检测信号存在良好的相关性(r2>0.999);牛乳中三氮脒的检测限为0.50×10-2μg/mL,定量限为0.010μg/mL。牛乳按0.010、0.10和1.00μg/mL 3个添加水平做三氮脒的回收率试验,回收率≥82%,变异系数在1.3～4.2之间。结果表明,本研究建立的三氮脒残留高效液相色谱检测方法重复性好,灵敏度高,操作简便,可用于牛乳中三氮脒残留的检测。     

过氧化氢酶-氯霉素偶联物的合成及其结合比的测定

利用混合酸酐法合成了氯霉素琥珀酸酯衍生物．再用碳二亚胺将该衍生物与过氧化氢酶偶联,用紫外分光光度法测定已纯化的偶联物中氯霉素与过氧化氢酶的结合比。结果,偶联物中氯霉素与过氧化氢酶的结合比达到30．67:1,偶联物中过氧化氢酶的活性损失约30％。结果表明,该偶联物可作为竞争性ELISA法或免疫传感器法测试氯霉素时所需的酶标抗原。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

鸡细小病毒荧光LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种可鉴别鸡细小病毒(ChPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据鸡细小病毒NS1基因的保守序列,设计了1套特异性引物,在该套引物的F3与B3区域中设计1个探针,其探针用FAM标记,优化建立了能鉴别ChPV的荧光LAMP检测方法,并使用所建立的方法对21份临床样品进行检测。结果显示,该方法特异性好,能检测到ChPV,并与其他禽类病毒无交叉反应;灵敏度高,最低能够检测1.02×10^-5ng/μL的ChPV DNA模板;对临床可疑样品的检出率为24%。表明,本研究建立的ChPV荧光LAMP方法具有简便快速、特异性好、敏感性高等优点,可用于检测ChPV。     

酮洛芬注射液在乳牛体内的残留消除研究

为建立牛乳中酮洛芬的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法,牛乳样品经甲醇提取,C18色谱柱分离,采用正离子模式,多反应监测,内标法定量。结果表明,牛乳中酮洛芬的检出限为1μg/kg,定量限为5μg/kg,在5~200μg/kg范围内线性关系良好,相关系数大于0.99。在25~100μg/kg添加水平的回收率为93.3%~107.5%,批内、批间相对标准偏差分别为1.72%~5.46%、1.13%~7.04%。该方法高效、灵敏、准确,可作为牛乳中酮洛芬的检测方法。选用20头健康的泌乳期荷斯坦乳牛,高产、低产各10头,以3 mg/kg剂量肌内注射给药,每天1次,连用3 d,分别于每次给药后第2、15小时采集乳样。每次给药后2 h牛乳中可检出酮洛芬,最高质量分数为(38.43±3.90)μg/kg,停药后15 h均未检出。所有时间点牛乳中酮洛芬质量分数的实测结果均低于加拿大规定的最高残留限量50μg/kg,建议弃乳期为0 d。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。