牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。     

牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白基因的克隆及其表达蛋白的生物学特性

将通过PCR技术扩增的牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白(Brucellaferric uptake,BfuA)基因克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-BfuA,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下表达出大小约为100ku的融合蛋白His-BfuA。Western-blot分析表明,His-BfuA能与布鲁氏菌阳性牛血清发生特异性反应,表明BfuA具有免疫原性。用His-BfuA作为包被抗原,对35份布鲁氏菌阳性牛血清进行ELISA检测,结果所有被检血清均为阳性反应,表明BfuA为潜在的可用于牛型布鲁氏菌诊断的靶蛋白。此外,对BfuA的亚定位结果表明,BfuA为膜蛋白;对His-BfuA的纤连蛋白结合活性及纤连蛋白溶酶原结合活性的试验结果表明,His-BfuA不具有上述2种活性。上述结果为牛型布鲁氏菌病诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。     

布鲁氏菌血清抗体量子点荧光微球检测试纸条的研制

为研制一种现场快速筛查布鲁氏菌病的免疫层析试纸条,本研究以量子点荧光微球作为示踪物,共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22,并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,组装试纸条。结果显示,量子点荧光微球试纸条检测阳性血清的最大稀释度为1∶512,检测布鲁氏菌病阳性血清的敏感性为99%,特异性为98%,与虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率为99%。且与结核病、蓝舌病、病毒性腹泻、口蹄疫及小反刍兽疫血清无交叉反应。上述结果表明量子点荧光微球免疫层析试纸条检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低,适用于布鲁氏菌病的现场筛查。     

布鲁氏菌延胡索酸水合酶与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性

依据牛型布鲁氏菌(Brucella abortus)延胡索酸水合酶(fumarate hydratase classⅠ,Fumhy)基因序列设计1对特异性引物,以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板,通过PCR扩增Fumhy基因的开放阅读框,连接到pMD18-T Simple载体上后进行序列测定和分析;将Fumhy定向克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-Fumhy,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下,进行Fumhy蛋白的表达,对表达的Fumhy蛋白进行免疫原性、与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性检测,研究Fumhy蛋白的免疫原性及相关的生物学活性。测序结果表明,Fumhy基因全长1 620bp,编码539个氨基酸;成功获得带有His标签的Fumhy重组蛋白His-Fumhy,大小为59ku,与预期结果相符合。Western-blot检测结果表明Fumhy蛋白具有免疫原性,且具有与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性。由此推测Fumhy蛋白可能参与布鲁氏菌在体内的感染过程。     

基于牛布氏杆菌重组外膜蛋白的混合抗原间接ELISA方法的建立

为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

禽大肠埃希氏菌O78和巴氏杆菌(5∶A)外膜蛋白的免疫研究

用超声裂解、Sarkosyl处理和超速离心法提取禽大肠埃希氏菌O78强毒株 (简称O78)、O78耐氯霉素弱毒株 (简称O78r)、禽多杀性巴氏杆菌 5∶A强毒株C4 8 1(简称C4 8 1)、O78r 与C4 8 1的融合双价弱毒株F4 (简称F4 )菌体外膜蛋白 (OMP)。经SDS PAGE结果显示 ,O78、O78r、C4 8 1与F4 均有 1条分子质量为 31.0～ 4 3.0ku ,分子质量相近的OMP条带 ;O78与C4 8 1还有 1条分子质量小于31.0ku且相近的OMP条带。用OMP制备的油乳剂疫苗分别免疫小白鼠 15d和岭南黄鸡后 2 2d ,以O78、C4 8 1强毒菌攻击 ,结果表明O78、C4 8 1的OMP不但对同源菌具有免疫作用 ,且具有交叉免疫保护作用 ;用各自的OMP作包被抗原 ,建立的ELISA方法也能交叉检测到 3组OMP免疫鸡产生的抗 2种菌OMP的IgG抗体。     

基于布鲁氏菌Dps蛋白间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为建立一种布鲁氏菌病早期快速诊断的血清学方法,进一步加强对布鲁氏菌病的防控.对布鲁氏菌Dps蛋白进行生物信息学分析、原核表达,将纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立了布鲁氏菌病血清学间接ELISA检测方法并进行初步应用.结果显示,当重组蛋白Dps包被量为0.25 μg,5％脱脂奶粉溶液封闭1.5 h,用稀释度为1∶1 0...     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

基于细胞色素b氧化酶基因序列的中国大陆日本血吸虫虫株种系发育分析

为分析中国大陆日本血吸虫不同地理虫株线粒体细胞色素b(cytochrome b,cytb)氧化酶基因的遗传多态性并重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系,以cytb基因作为研究对象对中国大陆11个流行地区日本血吸虫虫株进行了扩增、测序.用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用Paup 4.0程序的MP法和NJ法及PUZZLE 4.1程序的ML法重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系;同时利用DNAS-tar 5.0中的Megalign程序进行相似性、碱基组成、转换、颠换分析.结果显示,对11个流行区的日本血吸虫PCR扩增后获得419 bp cytb部分序列,检测到7个变异位点,变异率为1.67%.种系发育关系分析发现,依据cytb基因可有效地区分我国日本血吸虫山区和湖区两种流行类型,显示种内遗传变异特点,并可将日本血吸虫与分体科的其他吸虫鉴别开来.因此,日本血吸虫cytb基因适合作为日本血吸虫分离株种系发育的遗传标记,也可以作为一种鉴别基因用于分体科吸虫的PCR鉴别诊断.     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

大肠杆菌耐热肠毒素b及其致动物腹泻的机理

介绍了大肠杆菌耐热肠毒素b(STb)的编码基因、理化性质、免疫学特征、分泌特征、毒性相关氨基酸残基、空间结构、膜受体以及STb致动物腹泻的机理。认为STb是一种十分重要的肠毒素,应进一步加强对STb及其致腹泻机理的研究。     

基于cytb基因对大熊猫等六种珍稀野生动物感染蛔虫的种系发育分析

为分析大熊猫、小熊猫、北极熊、黑熊四川亚种、浣熊和猕猴等6种野生动物蛔虫cytb基因的遗传多态性及其种系发育关系,对这6种野生动物寄生蛔虫cytb基因进行了扩增与测序分析,并分别构建NJ、MP和ML系统进化树。结果显示,六种野生动物寄生蛔虫的cytb基因经PCR扩增后共获得长度均为875bp的序列,其中大熊猫、小熊猫、北极熊、黑熊四川亚种和浣熊寄生的蛔虫cytb序列中包含了156个变异位点,而寄生于猕猴的蛔虫与寄生于猪的猪蛔虫在cytb序列上存在11个位点的差异。系统进化树显示,大熊猫等6种野生动物蛔虫聚类成贝蛔属分支。表明cytb基因适合于野生动物蛔虫的分类鉴定以及种系发育分析,可用于野生动物蛔虫的鉴别诊断。     

论伊斯兰政治文化功能(下)

伊斯兰政治文化与法律密切相关,两者相辅相成.政治文化中包括法文化,其内容主要包括:<古兰经>立法、教法、民法和刑法等.在一定程度上,伊斯兰教法是对政治文化的有力支撑.伊斯兰政治文化思想首先源于<古兰经>,贯穿于民法、刑法等诸法律中.认主独一、服从真主和使者,成为宗教信仰与政治文化一元论的政治观,构成了伊斯兰政治文化的基础、核心和主导思想.伊斯兰文化与政治、宗教、宗教观念相通,尤其是认主独一的信念具有突出的宗教内容.在当代伊斯兰文化整合与重建中,<古兰经>和圣训居核心文化地位,公议和类比作为法律补充.伊斯兰教的政治力与当代伊斯兰运动有渊源关系,在多数情况下,一经民主选举,伊斯兰势力就能获得成功,并有多米诺骨牌的效应.     

伊斯兰主义向何处去?(下)

九一一事件后,美国在全球范围内展开了一场反对恐怖主义的战争,并先后用武力推翻两个穆斯林国家的合法政权,不仅如此,美国还在伊斯兰世界推行民主变革,以铲除伊斯兰极端主义滋生的土壤。人们总是小心翼翼地避免把反恐战争描绘成不同文明之间的冲突。然而,无庸讳言,九一一事件和反恐战争还是将西方(美国)与伊斯兰世界、基督教与穆斯林等具有强烈对比的话题摆在了人们面前。本文力图以历史唯物主义为指导,通过分析伊斯兰主义的发生与发展历史,对当代伊斯兰主义的未来发展趋势做出判断。与以往的研究类似,笔者坚持把伊斯兰主义的研究建立在3个纬度之上,即伊斯兰主义与西方世界的关系、伊斯兰社会内部的变化、伊斯兰教的内部特点。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。     

日美"2+2"会议文件与日美同盟转型

2007年5月,日美举行外长与防长"2 2"会议,发表《同盟的变革:日美安全及防卫合作进展》共同文件。该文件赋予日美同盟新的内涵,确认了几年来同盟转型的成果,详细说明了日美如何联合运用导弹防御系统为"提高整体威慑力"服务,并指明同盟的未来方向及重点。其中还有部分表述涉及中国,由此可以预料,该共同文件的落实必将对中国产生影响。