电化学免疫检测技术简介

电化学免疫检测技术是近十几年发展起来的一种微量检测新技术,主要用于生物活性物质如抗原、抗体、激素等的检测。它将免疫反应的特异性和微电子技术结合,使免疫检测具有精度高、速度快、适合于小型化和集成化,显示了广阔的发展前景。(一)原理 电化学免疫检测是根据抗原、抗体特异结合的原理,首先把抗体或抗原结合在载体或电极表面,即进行抗体或抗原的固化。然后用固化的抗体或抗原与待测样品中的抗原或抗体反应,用直接或间接法测量电化学信号的变化,从而得出待测样品中抗原或抗体的浓度。(二)分类 电化学免疫检测技术大致可以分为两大类:1.直接测量法:是利用抗原、抗体反应产生抗原—抗体复合物的膜电位,用电化学传感元件测     

口蹄疫病毒抗原与红细胞化学联结的方法及其应用

病毒或病毒蛋白抗原以及免疫球蛋白抗体与红细胞通过化学联结剂结合形成复合物,作为免疫反应的指示系统,在免疫测定中已经得到广泛应用。病毒抗原-红细胞复合物已经用于凝胶溶血试验(Charan等,1981;Jochim和Jones,1981)、被动血凝(Ikram和Prince,1981)及被动血凝抑制试验(Tokuda和Warrington,1970)检测病毒抗体,Johnson(1974)、Kim(1975)和Mclaren(1978)等用溶血斑试验(Hemolytic plaque assay)检测了淋巴细胞产生的抗体。将免疫球蛋白抗体与红细胞偶联可用于检测相应的抗原。H.A.等(1972,1973)用反向被动血凝反应鉴定了口蹄疫病毒型和亚型。M.M.Rweyemanu等(1980)用单辐射溶血技术(Single Radial Hemolysis Technique)检测了口蹄疫病毒的抗体和抗原。     

应用单克隆抗体探针检测牛白血病病毒抗原

应用抗牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp~(64))抗原单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别检测了培养细胞、生物制品及感染牛羊组织内BLV抗原。结果:FLK/BLV细胞系中BLV抗原生成规律为,培养1～4天时,细胞系中BLV抗原分泌量依日递增,5～7天时,抗原生成量趋于平衡;通过对3批琼脂免疫扩散(AGID)诊断抗原的检测可进行质量评价;实验感染BLV传代绵羊淋巴细胞内BLV-gp抗原全部阳性;我国江南某奶牛场200头奶牛淋巴细胞样品中,75头样品BLV抗原阳性。检出率37.5％。AGID法检出BLV抗体阳性牛56头,检出率为28％。两种技术检测的符合率为88.5％;哈尔滨市郊某奶牛场100头奶牛淋巴细胞样品,抗原抗体检测均为阴性。本方法特异性、敏感性强,为地方流行性牛白血病(BEL)的检测开辟了新途径,建立了新技术。     

免疫萤光技术在兽医诊断上的应用

免疫萤光技术,是根据免疫学上的抗原和抗体相遇时,发生特异性的反应这一现象,即将已知抗体(或抗某种传染病的血清)用一种萤光色素处理,使其互相结合,然后用这种含有萤光色素的抗体,对未知抗原(或病原材料)进行染色,染色后在紫外线显微镜下观察。如果抗原和抗体之间存在有特异性,则显示有特异萤光,从而可以识别未知抗原。     

免疫荧光技术在牛羊边虫病诊断上的应用

1950年Coons创立免疫荧光技术(Immuno-fluorescent Technique),当时主要应用其鉴定组织细胞中抗原的确切部位。Herbert,W.J.(1974)认为这种技术实质是一种沉淀反应。反应中抗原固定在载玻片上,标记抗体则沉淀在它的周围。应用已知的抗血清就可以检定出玻片上是否有特异性抗原存在。Weller,T.H(1954)改进这种方法用来检查血清中是否含有与某种抗原相对应的抗体,这样形成了间接荧光抗体技术(Indirect FluorescentAntibody IFA)。而且还可以将血清稀释,直到荧光消失,测定出抗体效价的近似值。(一)荧光抗体技术在诊断边虫病上的研究概况 Ristic(1957)首先应用荧光素标记的抗边虫球蛋白来检测可疑带虫血片,同Romanowsky’s染     

抗独特型抗体及其在疫病防治上的研究进展

自从1974年N.K.Jerne提出免疫网络学说以来,对于抗独特型抗体的研究日益增多,尤其是在感染性疾病的研究中,已显示出诱人的发展前景。Jerne认为,机体免疫系统内的各个细胞克隆,通过自我识别,相互刺激,或相互制约,构成一个动态平衡的网络结构。构成网络结构的物质基础,就是位于抗体分子上的独特型和抗独特型。Jerne因此在1984年获诺贝尔奖。 (一)抗独特型抗体的生物学基础 抗体是一类在抗原物质对机体刺激后所形成的、具有与该抗原发生特异结合反应的球蛋白。目前常把具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白,通称为免疫球蛋白(Ig)。Ig分子上有两种性质截然相反的部位,其     

鸡新城疫快递诊断抗原制备方法

(一)原理 鸡新城疫快速诊断抗原是根据Zergar(1949)等的方法加以改进而研制成功的,其原理是加大抗原中病毒含量,使血球凝集加快。当抗原病毒含量固定,血清抗体可延缓血球凝集时间,随着抗体含量增加而延长;当抗体含量固定,则血球凝集时间与病毒含量之间成反比。因此,把抗原病毒含量固定到一定的数量上,就可用来测定血清中抗体含量。 二)种毒选择 快速诊断抗原要求病毒含量达到6～8秒可使血球发生凝集的强度,即2个平板凝集单位,相当试管法1280倍。因此,目前只能用Ⅱ系和Ⅳ系鸡新城疫病毒来制备抗原。     

单克隆抗体探针在地方流行性牛白血病诊断中的应用研究

应用3批牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp)抗原的单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别对1172头奶牛淋巴细胞样品进行了BLV抗原检测;还用琼脂免疫扩散(AGID)和酶联免疫吸附(ELISA)试验对这些奶牛的血清样品进行BLV抗体检测,作为MAB探针检测试验的回归对照。结果是3批探针对BLV洁净牛群抗原检测全部阴性;BLV污染群的1072头奶牛淋巴细胞样品的BLV抗原检测阳性率分别为39.1％,39.2％和39.3％;检出符合率达99.5％(McNemar检验P>0.05)。AGID和ELISA试验对BLV抗体检出阳性率分别为32％和41.1％。抗原和抗体检出的符合率在洁净群为100％;在污染群中分别为82.6％和84.5％。其结果经统计学分析证实,MAB探针检测BLV抗原是一种非常特异、敏感、稳定的检测技术。     

抗独特型抗体的应用

近年来,围绕免疫网络学说进行的研究异常活跃,研究结果不仅有重大的理论价值,而且在疾病预防和治疗上的意义也日趋明显。关于独特型的结构基础和免疫网络学说的论述很多,在此不再赘述,本文仅就抗独特型抗体的应用作一概述。 (一)抗独特型抗体代作疫苗 抗独特型抗体的疫苗样效应最初是在研究抗胰岛素抗体的过程中观察到的。现在已经知道,内映像抗独特型抗体(Ab_2β)具有模拟始动物抗原的作用,这就提示我     

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定

为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。     

H9型禽流感毒株免疫对H5型禽流感抗体检测的干扰试验

利用禽流感病毒(AIV)美国H9型毒株、江门H9型毒株和广东某厂家生产的含AIV毒株的几种禽用商品疫苗分别免疫40日龄的肉用鸡.通过首免和超免疫后采集首免血和超免疫血分离血清,分别用自制H5型抗原(美国毒株)、广州H5型抗原(香港毒株)和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所H5型抗原对上述免疫鸡血清进行血凝抑制试验(HI),测定这些H9型毒株免疫的抗血清对H5型抗体检测的影响.试验结果表明,单纯的H9型毒株免疫的抗血清不构成对H5型抗体检测的影响.而含AIV抗原的商品疫苗免疫的鸡血清部分显示H5型抗体阳性,说明某些商品疫苗中含H5型抗原.用美国H5型毒株免疫的鸡血清进行反向验证试验,也未发现对H9型抗体检测的影响,表明H5和H9型AIV不存在同源抗原,因而在二者抗体检测中不存在相互干扰的问题.     

酶联接(标记)免疫吸附试验

(一)定义酶联接(标记)免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,以下简称ELISA),是根据抗原与抗体的免疫反应原理和酶的高效催化作用的显色原理,以酶降解底物而显色浓淡和消光值大小为指标,用酶标记的抗免疫球蛋白抗体检测特异性抗体或抗原的一种较敏感的技术。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒(EAV)免疫SPF豚鼠,4周后采血做血凝抑制试验(HI),其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应,抗原和抗血清在4℃感作24 h后可以检测到最高的HI抗体效价,同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关.对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验(NT)进行EAV抗体检测,HI和NT阳性符合率为94.7%,血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关.     

ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

地方流行型牛白血病(EBL)是由牛白血病病毒(BLV)引起的以淋巴细胞异常增生为主要特征的传染病。牛一旦感染则终生带毒,并且伴有病毒抗体存在,据此许多国家用免疫扩散试验(IDT)检测BLV抗体来分群隔离感染牛,旨在从牛群中清除牛白血病。然而IDT的敏感性有限,在结果判定上也易出现主观误差。近十年来,有许多学者将ELISA用于BLV抗体检测,试图建立一种敏感特异和快速的方法,结果因抗原提纯不过关而很少有成功的报道。我们用免疫亲和层析法提纯BLV抗原获得成功,抗原不但纯度高,而且彻底除去了犊牛血清中IgG的干扰,在此基础上建立了ELISA术式,取得了满意结果。     

固相补体结合反应检测马鼻疽抗体的试验

根据抗原结合特异性抗体,进而消耗补体的原理,我们将鼻疽病料(被检血清)与相应抗原和补体混合液,经一定条件致敏后,滴加于混有溶血素和绵羊红血球琼脂糖凝集板孔内,置37℃温箱反应2小时后观察结果。以孔的周围是否出现溶血圈或以试验孔与对照孔溶血圈直径之差进行判定。当被检血清含有鼻疽抗体时,便与相应的特异性抗原结合,进而消耗(结合)补体。由于补体被抗原抗体复合物所消耗,在致敏血球琼脂糖板孔内,不再发生溶     

台湾乌鸡种蛋中八种禽病抗体的检测

1992年8月,在入境 旅客行李检疫中截留一批 台湾乌鸡种蛋,共180枚。 经抽样提取卵黄液,用8种常见禽病抗原检测,从中检出禽败血霉形体(MG)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性支气管炎(IB)、鸡白痢(PD)和禽腺病毒抗体。 (一)材料和方法 1.抗原及标准阳性血清:IBD、IB、PD、传染性喉气管炎(ILT)、禽痘(AP)和腺病毒琼扩试验抗原及阳性血清,新城疫病毒(NDV)血凝抑制(HI)试验抗原及阳性血清,MG玻片凝集试验抗原及阳性血清均由哈尔滨兽医研究所购入。     

应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫 (Cryptosporidum parvum )子孢子表面抗原CP15为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为 :大肠埃希氏菌CP15抗原包被量为 1μg/孔 ,用10 0mL/L的兔血清进行封闭 ,以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明 ,应用CP15重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点     

猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

用羊肝囊液纯化抗原免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化培养,获得3株分泌McAb的杂交瘤细胞株1D_3、3H_(11)和9E_(11)。3株McAb均属IgG_1亚类,能与人源和羊源的细粒棘球蚴囊液抗原反应,不与细颈囊尾蚴、肝片吸虫、脑包虫或弓形虫抗原反应。腹水中抗体的IHA最高效价可达2~(-13)。杂交瘤细胞经冻存、复苏和连续传代培养,分泌抗体性质稳定。