牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒及牛支原体三重Nano-PCR方法的建立与初步应用

为了同时检测临床上牛常见的三种呼吸道重要病原体,本研究针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛支原体（MB）保守基因进行引物设计,并成功构建标准阳性质粒。使用纳米金颗粒将普通PCR方法优化,建立了三重Nano-PCR检测方法。结果显示,三重Nano-PCR检测方法可同时检测出BVDV、IBRV和MB的阳性质粒（1μL）最低检测分别为1 fg、100 ag、10 fg,灵敏度分别为常规PCR的10、10、100倍。临床结果显示,30份采集于临床呼吸道病牛样品中,BVDV、IBRV和MB的Nano-PCR的检测阳性率分别为33.33%、36.67%、33.33%,而普通PCR的检测阳性率分别为26.67%、30%、20%,提示BVDV和IBRV混合感染最多,阳性率可达26.67%。三重Nano-PCR方法特异性良好,检测其他牛呼吸道相关病原体BCV、BPIV3和BRV时结果均呈阴性。本研究建立的快速灵敏且特异良好的三重Nano-PCR检测方法可广泛应用于临床诊断和流行病学筛查。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV218bp片段的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV标准毒株OregonC24V中扩增出了218bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID50。不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。表明,建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

牛病毒性腹泻病毒可视化一步RT-LAMP检测方法的建立

为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5′UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg²⁺和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl₂、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验。结果显示,经优化本方法在66℃30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100%。结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果,抗体的最佳包被量为150μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶200;封闭液为50mL/L的兔血清;待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃120min;底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测,结果,阳性检出率为42.6%。     

猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。     

牛病毒性呼吸道疾病主要病原多重PCR检测方法的建立与应用

为建立对牛呼吸道疾病综合征(BRDC)进行快速而准确的病原学检测方法,基于牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g B 基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5′UTR 基因、牛副流感病毒 3 型(BPIV3)HN 基因和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) N 基因设计检测引物,经过条件优化,建立了检测 IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV的多重 PCR 方法。 该方法具有良好的特异性和灵敏性,可特异性地同时检测 IBRV、BPIV3、BRSV 和 BVDV,灵敏度分别为 5.86×10³、2.42×10³、1.02×10⁴和 5.02×10⁴copies/ μL,且重复性良好。 利用该方法对采集的309 份具有呼吸道症状牛的鼻腔拭子进行检测 ,结果显示 ,IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV 的阳性率分别为6.15%、28.16%、18.12%和 33.66%,其中 BVDV 与 BRSV 的混合感染率为 5.18%,BVDV 与 BPIV3 的混合感染率为 1.62%,BRSV 与 BPIV...     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

猪源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

从福建省某猪场疑似猪瘟的发病仔猪采集病料,处理后接种于牛肾细胞(MDBK),分离到1株病毒,并对其进行了系统鉴定.结果显示,病料接种MDBK细胞72 h后产生了明显的细胞病变;该分离毒株可以被牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清中和,中和效价为1:106;该分离毒株对氯仿、乙醚、胰酶、酸敏感,不耐热,56℃30 min...     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定

筛选建立了 8株牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )单克隆抗体杂交瘤细胞 ,通过对其染色体的分析、单克隆抗体免疫球蛋白类型及病毒中和活性等指标的检测 ,表明 8株单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目均接近两亲本细胞的染色体数目之和 ;单克隆抗体免疫球蛋白类型均为IgG ,其中 6株为IgG1,2株为IgG2a ,且对BVDV具有不同程度的中和能力。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

染料法实时荧光PCR检测牛嵴病毒

牛嵴病毒(BKoV)可能是与犊牛腹泻相关的潜在病原,为建立快速检测BKoV的方法,本研究根据BKoV3D基因的保守序列,设计特异性引物对,通过优化反应条件和体系,建立了基于EvaGreen染料检测BKoV的实时定量PCR方法.该方法Ct值与模板在1.08×102～1.08×108copies/μL范围内线性关系良好,扩...     

牛病毒性腹泻病毒生物型转化分子机制的研究进展

从病毒基因与宿主细胞基因的重组、病毒基因的复制与重排、病毒基因的重复复制和序列插入、病毒基因的缺失和点突变几个方面阐述了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)由非致细胞病变型(NCP)向致细胞病变型(CP)转化的分子变异机制。总结了前人对NCP型向CP型BVDV转化研究的结果,归纳了5种生物型转化形式,揭示了BVDV具有高变异性。     

牛病毒性腹泻病毒Erns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的生物学功能,将含有牛病毒性腹泻病毒 Erns基因的质粒pMD18-T-Erns经BamH I／HindⅢ双酶切,获得了Erns片段,再与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A连接,构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns与Bac-N-BlueTM DNA 共转染至sf9昆虫细胞中,获得了重组病毒,经噬斑筛选纯化,感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS- PAGE分析结果表明,表达的目的蛋白大小约30 ku;Western-blotting检测表明,该蛋白具有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NCD毒株,采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,并根据BVDV NADL参考株序列设计合成的1对引物(W1与W2),进行反转录PCR(RT-PCR),扩增出P125基因区约400bp的片段.经pGEM-T载体连接后克隆、测序,并与已发表的NADL、Osloss、SD-1、184、D、H、Yak等BVDV毒株序列进行比较.结果表明NCD株P125基因区无插入或缺失变异,但存在着核苷酸的替换;经聚类分析初步认为NCD株属于Ⅰa型.NCD株与长春184、H株核苷酸序列差异较大,而亲缘关系较近,表明BVDV在同一地区存在不同进化来源的毒株.     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

牛支原体牛多杀性巴氏杆菌与牛传染性鼻气管炎病毒三重PCR方法的建立与初步应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、多杀性巴氏杆菌(PM)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的三重PCR检测方法,笔者设计1对特异性引物,引用文献的2对引物,对反应条件与反应体系进行优化,建立了一种三重PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,最佳退火温度为51.7℃,最佳引物终浓度均为0.5μmol/L;敏感性结果显示,MB、PM、IBRV的最低检出限分别为3.9×10^-3ng/μL、6.61×10^-2ng/μL与2.97×10^-2ng/μL;特异性结果显示该方法只能特异性检测出MB、PM和IBRV。利用建立的三重PCR方法对108份临床病料进行检测,结果与单一PCR一致。结果表明,该方法可用于临床快速检测MB、PM、IBRV。