免疫脂质体技术

脂质体(Liposome)一词首先由Bangham等(1965)提出,是由人工方法形成的磷脂双分子层完全封闭的球状微囊,内含有水相空间,具有独特的理化及生物学性质,早在一百多年前Virclow(1884)观察到髓磷脂可以形成脂质体,随后Le-hma等(1904)曾描述过所见到的脂质体结构,进入60年代,对脂质体的系统研究日益受到有关学者的重视,80年代以来,国内外广泛开展了脂质体在人工生物膜、药物投送,免疫佐剂、基因工程载体和免疫诊断技术等领域的深入研究。本文仅就免疫脂质体技术作一概述。     

脂质膜体技术

脂质膜体是由包围水空间的连续双层排列的类脂组成的膜体。它有免疫脂质膜体、小单层指质膜体、去垢剂透析脂质膜体、反相蒸发脂质膜体及溶剂蒸发脂质膜体之分。目前这一新兴技术已在免疫诊断、药物投递方面得到应用,特别是在药物投递方面近几年又有新的发展。现就脂质膜体的制备和性质、脂质膜体在免疫诊断中的应用、免疫脂质膜体及其在体内的应用等问题作一浅述。 (一)脂质膜体的制备和性质 脂质膜体是类脂分子以连续双层结构包着一个水的空间。水溶质不能穿过类脂双层,这样就能诱捕各种大小的水溶性分子、离子直到大分子。用于脂质膜体构成的最普通的类脂为磷酸类脂,由于它有一个极性的头簇和两条非极性的酰基链,所以它具有两性分子的性质。脂质膜体表面     

吡喹酮脂质体的研制

以氢化豆磷脂和胆固醇为膜材 ,采用逆相薄膜蒸发法制备了吡喹酮脂质体 (PZQ Lip)。经电镜和光镜检测显示 ,PZQ Lip粒径大部分为 2～ 5 μm ,并以大单层脂质体为主 ;3批PZQ Lip的平均包封率为 71.8%± 2 .2 % (n =3 ) ,平均含药量为 8.9%± 0 .2 % (n =3 ) ;用建立的反相高效液相色谱法 (RP HPLC)检测PZQ时 ,简便、准确 ;绝对平均回收率按照低、中、高 3个浓度水平 ,依次为 99.7%± 1.4%、99.8%± 1.7%、99.5 %± 1.8%     

利福平脂质体在小鼠体内的组织分布

用微生物测定法对利福平脂质体在小鼠体内各组织中的药物浓度进行测定,研究了给药后组织中的药物浓度及分布情况,并将其与游离的利福平作比较.结果表明,小鼠单剂量静脉注射10 mg/kg体重游离的或脂质体利福平后,测定5 min及0.5、1.0、1.5、2.0和6.0 h各组织中药物浓度,以肾(游离型)和脾(脂质体型)浓度为最高.与游离的药物相比,利福平脂质体明显提高了在肝、脾、肺、血清中的药物分布,降低了在肾中的分布,表明利福平脂质体具有器官靶向作用.     

三黄鸡IFITM3基因的克隆及其真核表达载体的构建

为研究禽类干扰素诱导跨膜转运蛋白(interferon-induced transmembrane proteins,IFITMs)基因抗流感病毒的功能和分子机制,用PCR扩增了三黄鸡IFITM3基因并进行序列测定及其编码蛋白的结构分析。在此基础上,构建了pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体并转染至DF-1细胞。分析结果显示,该基因随物种发育进化地位的不同而表现出种属间差异性,编码蛋白由113个氨基酸构成,存在2个潜在跨膜区,不含信号肽。转染结果显示,pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体在DF-1细胞中成功表达。研究结果为构建IFITM3专性表达细胞系及三黄鸡IFITM3蛋白抗病毒分子机制的研究奠定了基础。     

免疫佐剂的作用机制及其应用

从抗原微粒化佐剂(如不溶性铝盐胶体、免疫刺激复合物、脂质体)、缓慢释放抗原佐剂(如油乳佐剂、抗原的微型包囊)、微生物佐剂(如细菌毒素、短小棒状杆菌菌苗、分枝杆菌及其成分、肽聚糖)、分子佐剂(如细胞因子、C3d分子、共刺激分子、超抗原、热休克蛋白、CpG序列)和其他佐剂(如维生素E、硒、抗生素类、拟胸腺素药物、蜂胶、中药多糖)等几方面阐述了免疫佐剂的性质、作用机制及应用的研究现状,为免疫佐剂的临床应用和进一步研制提供了参考资料。     

用于检测盐酸克伦特罗残留的免疫传感器感受器部件的研制

为研制用于检测农产品中盐酸克伦特罗残留的免疫传感器的分子识别元件———感受器 ,用二醋酸纤维素作为载体支架结构 ,戊二醛作为交联剂 ,己二胺作为制孔剂 ,对制备载体膜的最佳方案进行了筛选 ,制备出了符合标准的载体膜。而后用效价为 1∶4 0 0的抗盐酸克伦特罗抗体包被膜与酶标抗原偶联 ,在测定体系中检测过氧化氢的减少量 ,以衡量感受器部件的灵敏度 ,并用标准品测定其最低检测限 ,同时设质控膜。结果表明 ,质控膜和测定膜的电流变化值差异显著 (P <0 .0 5 ) ,感受器部件反应灵敏 ,最低检测限达 0 .3μg/L。     

抗独特型抗体及其在疫病防治上的研究进展

自从1974年N.K.Jerne提出免疫网络学说以来,对于抗独特型抗体的研究日益增多,尤其是在感染性疾病的研究中,已显示出诱人的发展前景。Jerne认为,机体免疫系统内的各个细胞克隆,通过自我识别,相互刺激,或相互制约,构成一个动态平衡的网络结构。构成网络结构的物质基础,就是位于抗体分子上的独特型和抗独特型。Jerne因此在1984年获诺贝尔奖。 (一)抗独特型抗体的生物学基础 抗体是一类在抗原物质对机体刺激后所形成的、具有与该抗原发生特异结合反应的球蛋白。目前常把具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白,通称为免疫球蛋白(Ig)。Ig分子上有两种性质截然相反的部位,其     

大熊猫轮状病毒CH-1株NSP4基因的克隆与生物信息学分析

用MA-104细胞增殖大熊猫轮状病毒(RV),并提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得NSP4基因,将其克隆到载体进行测序,应用生物信息学方法初步分析NSP4基因的结构及功能,并与不同动物的RV构建系统进化树。结果显示,获得了长750bp的大熊猫RVNSP4基因,此序列包含1个528bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫RVNSP4基因的理论分子质量为20223.7u,等电点为6.84,半衰期为30h,不稳定系数为30.40,总平均亲水性为-0.240,疏水性为-2.400～2.622;无信号肽序列;跨膜结构分析表明,NSP4有1个跨膜区,其N端位于病毒膜外区,C端位于病毒膜内区;抗原表位预测显示,NSP4有6个抗原决定簇;结构预测显示,其可能包含2个N-糖基化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化作用位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点;系统进化树分析显示,大熊猫RV NSP4基因与猪RV NSP4基因的进化距离最近。     

禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。     

成年牦牛肾内各级动脉管壁的显微结构观察

运用组织学方法对成年牦牛肾内动脉的管壁结构进行观察,并通过形态学计量分析,探索肾内各级动脉的组织结构特征。结果表明,牦牛肾动脉分为弹性动脉和肌性动脉。弹性动脉内膜较厚,中膜有丰富的弹性膜和弹性纤维,三层膜分界不明显。弹性动脉向肌性动脉过渡时内弹性膜可分出次级弹性膜并出现断裂,断裂处有较多的纵行平滑肌细胞。肌性动脉内皮下层包含纵行的平滑肌束,当血管收缩时突出管腔呈内膜嵴状,内膜中的纵行平滑肌可延伸至中膜层成为其普遍的组成成分。动脉管壁中膜层与血管外径的百分比(MT)变化幅度很大(14.2%～43.83%),均值为28.21%,说明成年牦牛肾内动脉管壁平滑肌相对增生变厚。管径越小的动脉管壁中膜层平滑肌和胶原纤维的含量相对增多,MT值较高,平滑肌的功能更发达。随着动脉管壁中膜层弹性纤维逐渐减少,胶原纤维和弹性纤维的相对面积比(C/E)明显升高,进一步说明低氧环境对牦牛肾动脉管壁构成有影响,特别是对微小动脉的影响非常显著。肾内各级动脉管壁的特殊结构可能是为适应低氧环境作出的改建。     

鸡柔嫩艾美球虫子孢子表面抗原基因λMzp5-7在Hela细胞中的表达

将已构建的柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)子孢子表面抗原pMD-Mzp5-7基因片段定向亚克隆到核酸疫苗载体pVAX1上,构建了真核表达载体pVAX-Mzp5-7,酶切鉴定正确后,用脂质体介导的转染法转染Hela细胞,进行了体外表达;并用裸DNA质粒经肌肉接种鸡体内表达。经Western-blotting及RT-PCR鉴定,表明该基因在Hela细胞及鸡体内均获得表达,并有一定的反应原性。     

磺胺嘧啶在猪体内的药物代谢动力学的研究

磺胺嘧啶(SD)是兽医临床上常用的抗菌、抗球虫和抗弓形体的药品,但该药在猪体内的代谢动力学研究却很少有人报道,往往造成兽医临床给药方案的不合理。据国外资料反映,磺胺类药物在牛体内的半衰期比人的半衰期要短。我国于1980年开始研究磺胺类药物在动物体内的代谢动力学。笔者对SD在杂交一代育肥猪体内的代谢动力学特征进行了研究,并取得了较为理想的结果。     

新城疫热稳定性天然弱毒B95株核酸疫苗的构建

将含有新城疫热稳定性天然弱毒B95株F基因的重组克隆质粒 pGEM F用NotⅠ单酶切 ,电泳回收纯化目的片段 ,与同样用NotⅠ单酶切并经去磷酸化处理的真核表达载体 pcDNA3.1连接 ,构建了新城疫核酸疫苗 ,并用所构建的新城疫核酸疫苗与载基因阳离子脂质体结合进行了免疫试验 ,通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达。结果显示 ,表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应 ,引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫 ,对新城疫强毒攻击的保护率为 75 %。     

pIRES2-EGFP-LR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为探讨层黏蛋白受体的生理功能及其在疾病发生、发展过程中的作用,以培养的SD大鼠大脑皮质神经元的总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了SD大鼠层黏蛋白受体基因.将其克隆到pMD18-T载体中,经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达栽体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-LR进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其表达情况.结果表明,真核表达载体plRES2-EGFP-LR构建成功并可以在293T细胞中表达.该表达载体可以作为研究层黏蛋白受体生理功能的重要工具.     

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白VP4基因的克隆与生物信息学分析

利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得大熊猫轮状病毒VP4蛋白基因,长2 362bp,包含一个2 331bp的开放阅读框,编码776个氨基酸,测序结果在GenBank中的登录号为HQ641296。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子质量为86 768.8u,理论等电点为5.56,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为28.64,脂肪指数为82.53,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911;无信号肽序列;跨膜结构分析显示VP4蛋白无跨膜区,位于病毒膜外区;在VP4序列中的抗原决定簇主要位于VP4的N-末端和C-末端。预测其可能包含8个N-糖基化作用位点,15个蛋白激酶C磷酸化作用位点、15个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、12个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析显示,大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最...     

丙硫咪唑脂质体对山羊肝片吸虫驱虫效果的观察

脂质体制剂作为新型的递药系统已受到人们的普遍关注。由于脂质体对单核巨噬细胞系统如肝脏、脾脏和淋巴结具有天然的趋向性,从而可作为治疗该系统的寄生性、感染性和肿瘤性疾病药物的可靠运载工具。广谱驱虫药丙硫苯咪唑(ABZ)对山羊、绵羊和牛的肝片吸虫具有一定的驱除效果,其作用强度与肝脏和胆汁中原型药物或代谢产物的含量有密切关系。因ABZ的理化性质所决定,国内外仍以内服剂型为主.     

脂质膜体技术(续)

(五)热敏感和酸敏感的免疫脂质膜体 1.热敏感免疫脂质膜体:热敏感免疫脂质膜体,受热时能释放出诱捕成份。利用由棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、Tm为41℃而组成的脂质膜体,在Tm以下或在Tm以上都是非常稳定的,而在41℃时,双层具有渗透性,其中的成份能迅速地由囊里泄漏出来。在Tm以上用声处制备SUV;当以41℃孵育时这些囊发生凝聚并融合,形成平均直径为95nm的更大的单层。以含有溶质的缓冲液,以Tm温度孵育融合的囊。与此同时,把棕榈酰抗体慢慢地(大约0.3ul/分)注射入这个悬液里,然后把温度降到Tm以下,透析悬浮液,除去残留脱氧胆酸钠和未包入的溶质。经蔗糖梯度离心除去未掺入的抗体,收获50％的掺合,诱捕溶     

弓形虫profilin蛋白基因的克隆表达及序列分析

为研究弓形虫profilin(prf)蛋白基因的遗传变异规律和表达产物的反应原性,以9个来源于不同宿主和地方的弓形虫虫株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增该基因并测序。将测序结果与从ToxoDB网站下载的4株弓形虫序列一起进行比对分析,用最大简约法绘制系统发育树。再以弓形虫RH株虫体总RNA为模板,使用RT-PCR方法扩增prf基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化入表达菌BL21(DE3)后,使用IPTG进行诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。同时,将弓形虫RH株prf基因编码区序列翻译成氨基酸序列,利用生物信息学软件对其亲疏水性、跨膜结构域、二级结构及B细胞抗原表位进行分析。结果显示,9个弓形虫虫株的prf基因长度均为3 552bp,一致性大于99.5%。系统发育树分析表明,弓形虫虫株的聚类没有规律。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,Profilin蛋白的分子质量约为30ku,且反应原性较好。蛋白结构预测结果显示,该蛋白含有4个亲水区,无跨膜区,7个α螺旋,8个β折叠,4个β转角,2个无规则卷曲和7个线性B细胞抗原表位。本研究结果表明,弓形虫prf基因可作为抗弓形虫疫苗候选分子。     

实验小鼠多房棘球蚴及化疗后的形态学观察

本文对实验性小鼠正常多房棘球蚴以及应用西药丙硫咪唑、中药(消包丸)、中西药治疗等条件影响下的多房棘球蚴进行光、电镜观察。光镜观察结果,小鼠正常多房棘球蚴角质层板层纹理不明显,生发膜由2～3层细胞构成。囊腔内有大量原头节和育囊。经过药物治疗的小鼠多房棘球蚴都出现角质层和生发膜变薄,生发膜细胞变性坏死,囊腔内无原头节或育囊,PAS阳性反应减弱或消失。透射电镜观察结果,正常多房棘球蚴角质层由疏松排列的纤维和颗粒构成。生发膜有大量发育良好的微毛伸入角质层内,皮层区有许多具有单位膜的空泡及少量微管。皮层细胞区主要由皮层细胞和肌细胞构成。经过药物治疗后角质层纤维和颗粒数量减少,甚至完全消失,是透明状。生发膜微毛变得粗短或消失,皮层空泡增多,微管扩张破裂,线粒体固缩,高尔基体与粗面内质网解体,胞浆内出现大量脂滴,严重时生发膜细胞变性坏死形成髓样物质、不定形物质。病理变化以中西药治疗组最明显,其次是西药和中药组。