猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立

根据已发表的PCV 1和PCV 2全基因组序列 ,设计了 3条引物 ,组成PCV 2的特有引物对和PCV 1、PCV 2的共有引物对 ,分别扩增长度为 4 72bp和 339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性 ,将 4 72bp的扩增产物纯化后 ,克隆到 pMD 18 T载体 ,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定 ,并测序。将该序列递交NCBI进行BLAST同源序列比较 ,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV 2毒株核苷酸序列的同源性均在 99%以上 ,与PCV 1毒株的同源性为 86 %。结果显示 ,该方法最少可用于 3μg病料组织和 0 .75 pgDNA的PCV 2检出 ,具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市 4 7份“猪高热综合征”病料 ,PCV 2感染阳性率为 36 .17% ,PCV 1单独感染阳性率为 34.0 4 %。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

鸭瘟病毒的PCR鉴定及相关序列分析

设计、合成了 2对鸭瘟病毒引物 ,对云南省发现的 1例鸭瘟可疑病例 (YN DPV0 1)进行PCR鉴定 ,并对其扩增产物进行测序。结果显示 ,引物对被检测病料的扩增正确 ;所扩增的片段经序列测定与参考毒株 p4 81的同源性为 99.5 %。     

应用PCR检测成年鸭体内鸭瘟强毒的分布

鸭瘟病毒 (DPV)强毒经人工接种和同居感染 10 0日龄鸭后 ,应用聚合酶链反应 (PCR)检测病毒在鸭体内各组织器官的动态分布。试验结果表明 ,DPV强毒经肌肉注射进入鸭体后 6h可在肝、脾、血液和粪便中检测到DPVDNA ;DPV强毒经肌肉注射到鸭体后各受检样品被检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、脾、血液和直肠粪便 (6h)→肺、脑和腿肌 (12h)→肾和胸肌 (2 4h) ;同居鸭于混群后 4 8h在肝、肺、血液和直肠粪便中检出DPVDNA ;DPV强毒经同居感染鸭后各受检样品检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、肺、血液和直肠粪便 (48h)→脾和脑 (72h)→胸肌和腿肌 (96h)→肾 (12 0h)。     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

牛CD14结构基因的PCR扩增及序列分析

在用牛肺巨噬细胞构建了ｃＤＮＡ基因文库的基础上，参照人和小白鼠ＣＤ１４的基因序列设计一对引物，用ＰＣＲ方法成功地扩增出编码牛ＣＤ１４的特异性ＤＮＡ片段，并进行了序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４基因的核苷酸在相同区域内与人ＣＤ１４的同源性为７９％，推导氨基酸序列的同源性为７３％；而与小白鼠的核苷酸和氨基酸的同源性分别为７５％和７１％。无论在核苷酸还是氨基酸水平上，牛ＣＤ１４基因与人ＣＤ１４的同源性都要高于与小白鼠的同源性。     

鸭坦布苏病毒AH-F10株全基因组的分子克隆与序列分析

为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征,利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了克隆,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果显示,毒株AH-F10的全基因组序列长10 990nt,含有1个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR)。序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性,其中与江苏JS2010株的同源性最高,达98%。研究还发现,鸭坦布苏病毒各分离株的5′UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94%~97%之间。此研究结果为进一步了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析.结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52 %(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0.病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞.PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段.扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%.结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况.     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1-4)中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明:鸭呼肠孤病毒(DRV)与禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76.0%~77.1%和78.4%~79.6%,氨基酸同源性分别为89.5%~91.2%和91.6%~92.7%;而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60.3%~64.4%和2.7%~9.9%,氨基酸同源性分别为61.4%~62.0%和22.6%~26.7%;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%~88.0%和93.1%,氨基酸同源性分别为97.1%、94.3%、95.7%~95.9%和93.7%。进化树分析表明,DRV与ARV形成不同的分支,DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

江西省断奶仔猪圆环病毒感染的初步诊断

20 0 1年 8月 ,江西省大范围发生猪生殖和呼吸系统综合征 (PRRS) ,继而在断奶仔猪群中发生一种以发热和进行性呼吸困难为特征的疾病。经过 1年多的研究探索 ,初步认为本病由猪圆环病毒 (porcinecircovirus ,PCV)感染所致。1　发病情况本病主要发生于PRRS流行严重的猪场 ,往往在采用PRRS疫苗控制了PRRS的病情后开始发生本病。断奶仔猪在保育饲养阶段 ,于网上通栏饲养发病更为严重 ,发病率达 30 %～ 6 0 % ,死亡率达10 %～ 2 0 % ,甚至更高 ;而在传统分隔式栏舍中饲养 ,发病率为 5 %～ 10 % ,死亡率为 3%～ 8%。本病发生有明显的年龄…     

广东省肇庆地区鸭疫里氏杆菌病的调查

在广东省水禽养殖较密集的肇庆地区选择4个鸭疫里氏杆菌病发病鸭场和1个未发病鸭场,采集病料,进行病原分离,并用玻片凝集试验和琼脂扩散试验检测分离株的血清型.结果表明,该地区流行的鸭疫里氏杆菌(RA)仍以1型为主,但有1株与RA 1型抗血清无交叉反应.对RA分离株进行8种抗生素的敏感性试验显示,分离株对丁胺卡那霉素极度敏感,对头孢唑啉、新霉素、头孢氨苄高度敏感,对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星有不同程度的抗药性.     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

鹅细小病毒和鸭瘟病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鹅细小病毒(GPV)和鸭瘟病毒(DPV)基因序列,分别设计合成了针对GPVVP3和DPV UL6基因片段的2对引物,以GPV-GZ1株鹅胚尿囊液和DPV-SD株鸭胚尿囊液的核酸提取物混合液作为模板,经优化反应条件,成功建立了检测GPV和DPV 2种病毒的复合PCR方法.特异性试验结果显示,该方法对GPV-GZ2株与DPV-SC株病毒核酸的扩增均获得550 bp和376 bp的2条特异性目的片段,而对鹅副黏病毒、鸭肝炎病毒、鸭源沙门菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为1.66 Pg,对DPV核酸为0.166 Pg;对人工感染雏鹅的肝组织进行PCR扩增,结果可检测到相应的特异性病毒核酸片段.表明,建立的复合PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和DPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断.