用光生物素标记核酸探针的研究

用放射性同位素标记核酸目前还只局限在一些有条件的实验室进行。另外,放射性标记探针还有保存时间短,危害人身安全等缺点。 本文介绍用光生物素标记核酸探针的方法,它既保留了生物素标记的优点,而且比应用放射性同位素方便安全。它不用缺口翻译方法进行标记,只用可见光照射即可标记成核酸探针,不管是DNA、RNA,还是单链双链皆可进行标记。这样核酸探针标记技术被进一步简化,使其更有利于临床应用。     

国产与进口光生物素标记核酸探针的比较

我们用澳大利亚Bresatic公司生产的光生物素与国内两家(称甲所和乙所)研制的光生物素进行标记核酸探针作了比较试验。 探针标记 在3个硅化玻璃管中,分别加入5μ1λDNA(0.5μg/μl),于暗室中再分别加入5.5μl光生物素(国产与进口的浓度均为1mg/ml),放在冰浴上,200w汞灯照射25分钟。然后加入100μl 0.1mol TE(0.1mol Tris/HCl pH9.0,1mmol EDTA),用仲丁醇抽提两次,下层水相的体积约剩45μl,再加入22.5μl 7.5molNH_4AC,20.1μl冷无水乙醇,-20℃过夜,15000r/min离心,抽干,分别溶于27.5μl TE中。     

光生物素标记核酸探针检测水貂肠炎病毒的研究

水貂肠炎病毒(MEV)的检测,目前主要采用病毒分离和血清学方法。为了能直接从样品中检测病毒,我们于1988年秋冬,首次采用了光生物素标记核酸探针打点杂交的方法,结果证明这种方法效果良好,能特异地检出MEV,且灵敏度高,可检测出10pg水平的病毒DNA。     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

地高辛标记核酸探针及其应用近况

地高辛标记核酸探针及其应用近况罗满林，李光富，蔡宝祥，陈溥言（南京农业大学２１００９５）核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆，检测感染性疾病的致病因子和诊断遗传病。最早使用的放射性同位素标记核酸探针，具有敏感性高，特异性好和分辨力强的特点，故沿用至今。但...     

光生物素标记DNA探针检测传染性喉气管炎病毒感染

用光生物素标记４．３ｋｂ的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＤＮＡ片段作为探针，检测５只人工接种ＩＬＴＶ的ＳＰＦ鸡在不同时期采集的喉拭子样品或血清，并检测采自自然发病鸡群的喉试子样品。结果表明，用核酸探针点杂交方法在人工感染鸡喉气管中检出ＩＬＴＶ的时间为接种后６～１０天；该法敏感、特异，对诊断ＩＬＴＶ感染有实用价值，特别适用于进出口检疫和ＳＰＦ鸡群的监测。     

核酸探针技术研究进展

为有效地控制和治疗疾 病,当前极需研究快速、可 靠、高度特异的诊断技术。因 通常使用的免疫学试验方法往往满足不了这些要求,不能可靠地区分两个紧密相关的种(或株);不能真实地说明动物当时的健康状况。随着科学技术和工业生产的发展,在今后的日子里,核酸探针、限制酶分析(REA),聚合酶链反该(PCR),单克隆抗体和ELISA等分子生物学诊断技术将会很快地走出科学家的实验室,成为广大的野外兽医和实验室工作人员诊断疾病的有力武器。在分子生物学技术里核酸探针技术是最有实用前景的     

核酸探针制备方法简介

随着分子生物学的飞速发展,利用核苷酸碱基配对原理建立的核酸杂交技术已广泛地应用于分子生物学、医学和兽医学的各个领域。核酸杂交技术的应用使疾病诊断由检测体内正常、异常成份变化的理化诊断方法和检测抗原-抗体反应的免疫学诊断方法发展到了基因诊断水平,从而使疾病的诊断更为准确、可靠。核酸杂交技术中,常用放射性同位素(~(32)P、~3H、~(35)S、~(14)C)或其它标记物(半抗原、酶、生物素)标记特异核苷酸片段来制备核酸探针。现将常用核酸探针制备的方法作如下简介。     

光生物素标记六邻体蛋白基因探针检测减蛋综合征病毒的研究

根据基因文库中减蛋综合征病毒 (EDSV)AV12 7株的序列设计 1对引物 ,从四川本地分离的EDSVSG930 1株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到PUC1 8的多克隆位点中 ,经PCR、酶切分析、DNA杂交分析和序列测定证明 ,所扩增、克隆的基因包括了六邻体蛋白基因从起始密码子到终止密码子在内的完整序列。用光生物素对含六邻体蛋白基因的重组质粒标记后 ,采用斑点印迹法对 4株EDSV(标准株AV 12 7株和 3株四川分离株 )、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒的核酸进行检测 ,结果 ,该探针能检测出 4株EDSV ,但不能检出新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒。表明该六邻体蛋白基因探针具有特异性 ,检测的灵敏度高达 12pg。     

生物素标记大肠杆菌热敏感和热稳定毒素基因探针对猪鸡分离株的检测

用特异的大肠杆菌热敏感毒素（ＬＴ）和热稳定毒素（ＳＴ）标记的基因探针，以硝酸纤维素薄膜为载体，对从猪、鸡分离的大肠杆菌进行杂交。结果表明，在从猪分离的４８株大肠杆菌中，分离自黄痢的３５株、分离自白痢的２株，分离自ＳＰＦ堵粪便的６株均产ＬＴ和５Ｔ；分离自长期拉稀的育成小僵猪粪便的５株中，只有４株产ＬＴ和ＳＴ，１株既不产ＬＴ也不产ＳＴ。从鸡分离的２８株大肠杆菌中，分离自雏鸡的１４株ＬＴ阳性率为８６％，ＳＴ阳性率为９３％；分离自中鸡的９株ＬＴ和ＳＴ阳ａ性率均为１００％；分离自蛋鸡的５株ＬＴ阳性率为４０％，ＳＴ阳性率为６０％。     

核酸探针应用中存在的问题与解决对策

核酸探针作为诊断试剂已应用于人和家畜传染病、寄生虫病及遗传性疾病的临床检测和流行病学的调查。但由于存在特异性和敏感性等问题,限制了进一步在临床医学和临床兽医学上的推广。本文就当前的核酸探针做为诊断试剂在应用中存在的问题做一简述和分析,并介绍几种解决这些问题的新技术。     

核酸杂交诊断检测技术概况

近年来,随着分子生物学研究的不断深入,利用重组DNA技术建立的核酸杂交诊断检测技术已经开始在病毒细菌的快速诊断,病毒分子流行病学调查,病毒核酸定量、细胞内病毒感染及整合病毒序列测定等方面应用,使某些疾病的诊断检测水平走向一个新层次。核酸杂交技术具有敏感性高,特异性强,简便快速等优点。它不仅可以检测游离的病原核酸,还可以分析整合于细胞DNA上的病毒核酸序列。有些疾病只有检测     

牛脊柱畸形综合征HRM-非标记探针检测方法的建立与应用

为建立用于牛脊柱畸形综合征(CVM)检测的高分辨率熔解曲线(HRM)非标记探针法,根据Gen Bank中SLC35A3基因序列设计PCR引物及非标记性探针,构建G/G型、G/T型、T/T型3种标准质粒,利用质粒作为标准品建立HRM特征图谱。采用优化的HRM-非标记探针法对305份荷斯坦奶牛血样及冷冻精液样品中SLC35A3位点的基因型进行检测,同时采用测序法进行验证。结果,305份样本中9份冻精样本为CVM携带者,携带率为2.95%,检测结果与测序法检测结果一致,准确率达100%。上述研究结果表明,本研究建立的针对牛CVM中SLC35A3基因G-T位点突变检测的HRM-非标记探针方法是一种简单快速、灵敏特异、高效准确的牛CVM有害基因分型检测技术。     

生物素—抗生物素系统在免疫检测技术中的应用与展望

自七十年代末,生物素与抗生物素系统(Avidin—Biotin System)已开始在免疫化学领域中广泛应用。尤其是因生物素和抗生物素之间亲合力大,特异性强,可分别结合各种类型大小生物分子,为免疫标记技术的发展提供了一种极为方便的工具。目前该系统已成为免疫学领域中最受欢迎的新方法。     

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定李光富，陈溥言，蔡宝祥，张林元，邓小昭，刁振宇（南京军区军事医学研究所２１０００２）马立克氏病毒（ＭＤＶ）不同毒株在毒力和产生组织病变方面有明显差异。最早是英国的Ｂｉｇｇｓ根据ＭＤＶ对鸡的致病和致瘤特性将的ＤＶ...     

用狄高辛标记DNA探针检测鸡马立克氏病病毒

用狄高辛标记ＤＮＡ探针检测鸡马立克氏病病毒白安斌，蒋玉雯，黄安国，盘宝进，姚瑞英，陈西宁，郑儒标，冯军（广西兽医研究所南宁５３０００１）三黄鸡是广西地方良种之一，对马立克氏病（ＭＤ）较外来鸡种敏感。尽管接种了疫苗，仍有ＭＤ发生。笔者用狄高辛标记ＤＮＡ...     

~（35）S标记的鼠干扰素γ和白细胞介素6RNA探针的制备和应用

分别制备由~（３５）标记的鼠干扰素γ（ＩＦＮγ）和白细胞介素６（ＩＬ－６）的ＲＮＡ探针，并用组织切片原位杂交技术检查了鼠肠道产生这两种细胞因子的阳性细胞的分布。结果表明，ＩＦＮγ和ＩＬ—６ｃＤＮＡ反义链ＲＮＡ探针具有高度特异性。     

基因探针在诊断微生物学的应用

对许多微生物来说,常用的普通培养分离法颇费时日,不能快速地做出临床诊断。而应用标记的基因探针,通过DNA杂交,以定位微生物染色体DNA特殊区段的基因,就可以确定受感染组织中是否存在该微生物的特殊基因组,不仅可以快速地检测出活的病原体,而且可发现有缺陷的病毒粒子和易于发生抗原变异的血液寄生物(Lee等,1985)。由于基因探针的同源性特点,不像多克隆抗体或单克隆抗     

光敏生物素标记IgG检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒囊膜蛋白及重组表达蛋白

用光敏生物素标记从兔抗羊接触传染性脓疱性皮炎病毒超免疫血清中提取纯化的IgG ,把从蔗糖密度梯度离心纯化的病毒用 2 ME和NP4 0裂解后与重组转化菌 pGRL 4A和pGRH 3A一起进行SDS PAGE ,并进行转移电泳。对用光敏生物素标记的IgG进行Western blot ting印迹杂交检测。结果 ,检测到产生IgG的病毒囊膜蛋白有 5条 ,分子量分别为 12 5 .0、96 .0、83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;检测到重组菌 pGRL 4A和 pGRH 3A可表达分泌其中的 3条囊膜蛋白 ,其分子量分别为 83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;pGRL 4A的表达较强 ,对 4 2 .0ku蛋白的分泌量最高。所重组的病毒DNAHindⅢ /A片段中含有该病毒囊膜蛋白抗原基因     

地高辛标记质粒探针监测大肠埃希氏菌对四环素抗药性的研究

用Ｂａｍ Ｈ Ⅰ和Ｎｒｕ Ⅰ双酶切质粒ｐＢＲ３２２ 的四环素抗药基因,经ＤＮＡ 纯化回收试剂盒和低融点琼脂糖挖块法回收纯化６００ ｂｐ 的目的基因片段;以随机引物法用地高辛进行标记,制备成探针;用斑点杂交法通过敏感性和特异性试验,证实这种探针用于检测四环素抗药基因是可行的。采用菌落原位杂交法检测了临床分离的７２ 株猪源大肠埃希氏菌四环素抗药菌株,与药敏试验的阳性符合率达９１ ．７ ％ 。