长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。     

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增,将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-nsp4,测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明,重组菌可表达分子质量约23 ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化,获得了高纯度的重组蛋白,Western-blot分析结果表明,nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上,成功构建重组表达质粒pET5-ORF6.将其转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经IPTG诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的26.8%,采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测,结果表明表达的蛋白显示特异性.     

结核分枝杆菌csdA基因的原核表达及其免疫原性

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 690 bp的csdA(cold-shock dead-box protein A)基因,经限制性酶切后,与pET28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中后,重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导表达了csdA蛋白及Ni-His-resin纯化蛋白,经Western-blot分析,鉴定了目的蛋白的反应原性。试验结果表明,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在64 ku处获得一目的条带,具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-csdA,获得了高纯度的重组蛋白,为深入研究csdA蛋白的功能奠定了基础。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

六部门动态优化模型在吉林老工业基地产业结构优化升级中的运用

产业结构问题是我国当前亟须解决的重大问题,产业结构的优化升级是经济均衡增长的关键。在相关理论方法还不够完善的背景下,构建适合国情的产业结构动态优化的理论与方法,为我国的结构调整提供有价值的参考,将具有深远的理论与实践意义。产业结构动态优化模型体系与吉林省的实证研究相结合,可以发挥区域优势,以科技进步促进产业的结构升级,解决供需结构失衡的深层矛盾。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

东北地区资源利用效率及对策研究

我国"十一五"规划明确指出,"十一五"期间我国要把节约资源作为基本国策,加快建设资源节约型社会。东北地区由于长期以资源开发和产品初加工产业为龙头的粗放型的经济增长方式,使其自然资源的优势逐渐丧失。经济增长方式转变的根本点在于提高资源利用效率,用较少的资源消耗获得较高的经济产出。以能源为例,对东北地区资源利用效率进行分析,历年的计算结果显示:东北地区能源消费总量增长减缓,能源消费结构逐步得到优化,能源利用效率逐年提高,但从绝对值看,仍低于全国平均水平。为构建资源节约型社会,可以通过优化能源消费结构、提高能源利用效率、优化产业布局等,促进东北地区经济发展与人口、资源与环境的全面协调。