大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.     

口蹄疫病毒诱导的牛α -干扰素基因cDNA的克隆及序列分析

参照已发表的牛α 干扰素基因cDNA序列设计了 1对引物 ,用感染口蹄疫病毒的牛外周血为材料 ,提取总RNA。经RT PCR ,获得与预期大小相符的DNA片段。所获得的PCR产物长度是 6 0 4bp ,与参考序列的同源性是 99.7%。第 2 3位～ 91位的 6 9个碱基为信号肽序列 ,编码2 3个氨基酸。与参考序列比较 ,第 4 3位的碱基由C变为A ,即由TTC→TTA ,对应的氨基酸由苯丙氨酸 (F)变为亮氨酸 (L)。第 4 5位的碱基由G变为C ,即由CGA→CCA ,对应的氨基酸由精氨酸(R)变为脯氨酸 (P)。第 92～ 5 89位的 4 98个碱基为牛α 干扰素成熟蛋白基因序列 ,编码 16 6个氨基酸 ,与参考序列完全相同 ,即同源性为 10 0 %。第 5 90～ 5 92位的碱基为TGA终止子。整个牛α 干扰素前体蛋白基因共 5 70个碱基 ,编码 189个氨基酸     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17(ChIL-17)基因的cDNA序列设计了1对特异性引物,以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp,其中第2~508位是该基因的阅读框(ORF),共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较,二者核苷酸序列的同源性为99.6%(722/725),共有3个碱基发生变异,其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为100%。同时,以鸡脾淋巴细胞DNA为模板,用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列,经序列分析,其序列全长1934bp,由2个内含子和3个外显子组成,3个外显子分别位于第2~27、569~815和1484~1720bp处。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因 ,采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现 ,所筛选的阳性克隆中有 2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 (SPI)。序列分析表明 ,它可编码分子质量为 4 .6ku ,等电点为 5 .76的蛋白 ,与GenBank中日本血吸虫SPI基因 (大陆株 )、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为 98%、6 2 %和 6 2 %。TMpred分析表明 ,该蛋白具有 2个明显的跨膜区即 36～ 5 5和 35 6～ 372位氨基酸。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-γ基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)技术 ,从鸡新城疫I系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素 γ(IFN γ)基因cDNA。结果表明 ,以 1∶5 0或 1∶10 0稀释度接种后第 4 8h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示 ,所克隆的洛阳土种鸡IFN γ基因cDNA与所报道的鸡IFN γ基因cDNA同源性为 99.7% ,相应的氨基酸序列同源性为 10 0 % ,说明鸡IFN γ基因编码区高度保守。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析

以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行了分析.序列分析结果显示,阳性克隆Zh68 cDNA全长为1 372 bp,含有1个1 287 bp的完整的开放阅读框架,编码由429个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为47.5 ku,等电点为8.45.SMART分析表明,1～18位氨基酸为信号肽序列,37～277位氨基酸为典型的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶类结构域,其中His88、Asp142、Ser233为催化中心的3个主要氨基酸残基,78～80位氨基酸为N-糖基化位点(NCS),另外还有6个保守的Cys形成二硫键.BLASTn同源性分析表明,与其他生物丝氨酸蛋白酶的基因序列无明显的同源性,为1个新的cDNA分子.BLASTp蛋白质同源性分析表明,与丝氨酸蛋白酶的同源性为30%左右.Southern-blot杂交表明,此基因在旋毛虫基因组中属于多基因家族,具有基因多态性.cDNA的PCR结果表明,此基因在旋毛虫肌幼虫、新生幼虫及成虫期均有表达.     

鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达

根据GenBank中鸡myostatin(AF019621)成熟区段的cDNA序列设计了1对引物,利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段,构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K,并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现,萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异:T204→C204(编码的氨基酸没有变),C205→T205(编码的氨基酸由Pro变成Ser),从而产生了1个EspⅠ或Bpu1102Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明,myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明,表达的目的蛋白(26 ku)具有生物学活性。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因,结果。均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到 pMD18-T载体上,获得重组质粒,经PCR和EcoR Ⅰ Sal Ⅰ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明,广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白,分子质量约为16．8 ku,与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％,氨基酸序列同源性分剐为23．6％～24．8％和97．6％～99．4％。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

牛CD14结构基因的PCR扩增及序列分析

在用牛肺巨噬细胞构建了ｃＤＮＡ基因文库的基础上，参照人和小白鼠ＣＤ１４的基因序列设计一对引物，用ＰＣＲ方法成功地扩增出编码牛ＣＤ１４的特异性ＤＮＡ片段，并进行了序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４基因的核苷酸在相同区域内与人ＣＤ１４的同源性为７９％，推导氨基酸序列的同源性为７３％；而与小白鼠的核苷酸和氨基酸的同源性分别为７５％和７１％。无论在核苷酸还是氨基酸水平上，牛ＣＤ１４基因与人ＣＤ１４的同源性都要高于与小白鼠的同源性。     

禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建

用蔗糖密度梯度离心纯化犬冠状病毒TN449株病毒液,提取总RNA并反转录,同时设计1对5′端加有BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点的引物,对病毒cDNA进行了PCR扩增,回收PCR产物将其连接入pGEM-TEasy载体并转化大肠埃希氏菌。并对阳性重组质粒菌测序和序列分析。结果,犬冠状病毒与牛冠状病毒、猫冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、人冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鼠传染性肝炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、人重症急性呼吸道综合征病毒和猪胃肠炎病毒的同源性分别是39.39%、85.41%、83.98%、36.80%、26.64%、37.23%、93.51%、29.00%和94.81%;犬冠状病毒M蛋白有3个疏水性结构域。同时构建了pET28a-CCV-M表达质粒。     

旋毛虫半胱氨酸蛋白酶基因TsCP1的克隆与序列分析

为了研究旋毛虫半胱氨酸蛋白酶的功能,根据GenBank中旋毛虫EST数据库的半胱氨酸蛋白酶基因部分cDNA序列设计引物,以旋毛虫肌幼虫总RNA为模板,进行RT-PCR,克隆到旋毛虫半胱氨酸蛋白酶基因(TsCP1)的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析。结果表明,TsCP1cD-NA序列含有一个由1 101个核苷酸组成的开放阅读框,编码由366个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质的分子质量理论值为41.9ku,理论等电点为7.46。TsCP1二级结构中α螺旋占31.4%,β折叠占15.3%。TsCP1第1～19位氨基酸残基为信号肽序列,具有3处N-糖基化位点,而且具有半胱氨酸蛋白酶的保守活性位点Cys173,His309及Asn333残基,另外在酶前体序列中有与组织蛋白酶F特征基序ERFNAQ相似的LKFNAQ序列,表明该蛋白属于半胱氨酸蛋白酶家族的组织蛋白酶F亚类。同源性分析表明与其他寄生性蠕虫组织蛋白酶F的一致性在40%以上,系统进化分析表明与吸虫的组织蛋白酶F属于不同的进化分支。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。