口蹄疫病毒温度敏感突变种物理特性和代谢特性的进一步研究

三株口蹄疫病毒温度敏感(ts)突变种,在非允许温度(38.5℃)下,配偶混合感染,根据病毒产量和结合的H~3-尿嘧啶核苷,被分类为RNA~-,并属于同一个互补组。只有突变种ts-22能在38.5℃产斑,它比亲本野毒或其他突变种病毒对酸更敏感。在38.5℃下,葡聚糖不能提高突变种病毒的产斑力。这几株病毒在允许温度(33℃)和非允许温度下,都能抑制宿主细胞蛋白质的合成。     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。     

牛、羊接种口蹄疫O、A型弱毒甘油苗后的血清保护抗体测定试验

全国各地根据需要逐渐开展口蹄疫O、A两型弱毒疫苗的共同注射,以节省时间与力量,为群众所欢迎。但接种后牛、羊产生抗体如何,国内资料甚少。农业部兰州兽医药品厂对用于生产血清的牛只进行了O、A两型口蹄疫预防注射,我所亦对在徐家坪饲养的健康黄牛、绵羊、山羊进行了O、A两型疫苗的预防注射,于注射后不同时间采血分离血清作乳鼠的血     

猪传染性水泡病诊断试验

一、猪水泡病乳鼠保护诊断试验 乳鼠保护试验是当前我国诊断本病较准确简便的方法。利用已知水泡病标准乳鼠毒或水泡病标准血清,与自然流行水泡病病猪恢复血清或水泡皮病毒做乳鼠保护诊断试验,方法是选择1～2日龄乳鼠,注射原血清或稀释10倍的血清,每只背部皮下注射0.1毫升,经24小时后连同对照乳鼠每只背部皮下攻击10倍稀释的乳鼠毒0.1毫升,凡注射原血清的乳鼠全保护,对照全死,初步诊断为猪水泡病。     

O型口蹄疫病毒冷变种的特性

在以前的报告中曾经指出,口蹄疫O型病毒在24℃犊牛肾细胞培养物中继代,可以促进其致弱。在24℃下培养75至90代以后,病毒致弱变种对牛和绵羊有显著的免疫原性。 通过在牛体上,对冷变种的试验证明安全有效(24℃,85～93代)。对免疫动物有0.3％的弱反应,在八个半月的观察期间,其中和抗体保持较高的水中(1:64～1:256)。但是在机体体温过低的情况下(周围环境温度为25～30℃),病毒变种反应性增高,并对未接     

同一份组培细胞繁殖(复制)两种病毒的研究

用同一份仔猪肾组培细胞先繁殖猪瘟病毒(中国猪瘟兔化弱毒),再繁殖口蹄疫O型病毒,猪瘟组培细胞毒兔检可达5 ×10~4ID/1毫升。O型口蹄疫细胞毒鼠测毒价可高达≥10~(8·5)“MLD_50/0.1毫升。 被猪瘟病毒感染后的细胞不发生细胞病变(cpe),大量繁殖猪瘟病毒后的细胞(即3～5次收毒后的细胞),再感染口蹄疫O型病毒,细胞病变率几乎达100％。从而说明猪瘟病毒与口蹄疫O型病毒是可以先后在同一份细胞内复制的。     

口蹄疫A型细胞组织培养弱毒疫苗、细胞组织培养兔体反应弱毒疫苗的研究——1972年工作总结

对6个半月～7个月及8个半月的免疫持续期试验,我们采用仔猪肾上皮细胞毒120代(病毒滴度=10~(-7.5))又连续适应3～4日龄乳兔三代,乳兔在接种后36～40小时出现典型口蹄疫症状,规律死亡。取其乳兔肌肉组织毒,制10％含毒量的甘油苗(病毒滴度=10~(-7.0)),该疫苗(7102批)在甘肃省成县红川公社、南康公社进行区域实验(该地区从1962年至今未发生过口蹄疫,也未注射过口蹄疫疫苗)。注射黄牛670余头,注苗6个半月～7个月及8个半月分别运回试验牛只,进行强毒攻击。所用强毒为牛源强毒A型44代,病毒滴度=10~(-7.0)     

牛O型A型口蹄疫双价灭活疫苗研究──—A型毒种的选择

收集保藏的６株口蹄疫（ＦＭＤ）Ａ型牛源强毒，适应乳鼠５代，转适８ＨＫ—２１细胞单层１０代，用弗氏完全佐剂制成疫苗免疫豚鼠。综合分析其对实验动物及制苗细胞的适应性、病毒感染性滴度、豚鼠抗强毒攻击的免疫原性、血清中和抗体应答的抗原广谱杜表明，在６株毒中ＡＦ／７２具有更好的适应性，病毒滴度高，免疫原性好，抗原谱广。     

口蹄疫病毒感染中乳鼠epsilon干扰素mRNA转录水平的实时荧光定量PCR检测

利用3~4日龄的乳鼠作为研究对象,在口蹄疫病毒(FMDV)MYA/98株攻毒后第0、5、10小时及濒临死亡期(第15小时)收集其肠道组织并提取RNA,用实时荧光定量PCR检测乳鼠IFN-ε表达量在感染前后及不同时间段的变化。结果显示,IFN-ε表达量在乳鼠感染FMDV前后以及不同时间段并没有发生明显的变化。本研究结果为进一步了解Ⅰ型干扰素的不同亚型及其在抗口蹄疫病毒感染中的作用提供了实验数据。     

口蹄疫、猪传染性水泡病的血清保护试验诊断法

(一)被检病毒液的制备:将送检病料洗净、称重、研磨,用生理盐水或磷酸盐缓冲液作1:5～1:10的悬浮液,在4℃浸出一日夜,或在室温浸出1～2小时,振(氵易皿),以3000转/分离心10分钟,其上清液即为被检的病毒液。 (二)乳鼠血清注射:用五窝2～3日龄的乳鼠,每窝10只,以一只母鼠哺乳,分别注射已知的猪水泡病及口蹄疫A、O、C、ZB型五个血清。每窝注射七只,留三只不注     

宿主细胞基因序列插入亚洲1型口蹄疫病毒导致病毒对牛的致病性减弱的研究

1株Asia 1型口蹄疫疫苗毒株在BHK21悬浮培养细胞中传代时与宿主BHK21细胞m RNA重组,导致VP1第206位与第207位氨基酸之间插入了VDLV序列,该插入突变使得疫苗免疫效果大幅下降,不能产生有效保护。比较发现,含12 nt插入序列的变异毒株(Vac-Asia1-VDLV)与亲本毒株(Asia 1/HN/06)在BHK21细胞上的生长曲线存在较大差异,变异毒株可感染CHO-K1,pgsA-745,pgsB-618,pgsD-677细胞,毒价可达到1×105PFU/mL以上,而亲本毒不能感染CHO类细胞并产生蚀斑。动物试验结果显示,乳鼠半数致死量(LD50)与亲本毒株相比变化不明显。但牛感染试验表明,大剂量(1×107LD50)接种牛舌面,Vac-Asia1-VDLV不引起体温反应和其它临床症状,荧光定量PCR检测鼻拭子和血液时未发现病毒,而Asia 1/HN/06引起典型的口蹄疫症状,鼻拭子和血液中检出病毒。上述试验结果表明,与亲本毒相比,变异毒株Vac-Asia 1-VDLV对牛的致病性明显降低。     

猪源口蹄疫病毒温度敏感株的分离及其对猪体的致病力

为了绘制口蹄疫病毒遗传图并培育可用于生产实际的活疫苗种毒,我们从1977年开始,通过rct_(40),对猪的致病力、蚀斑类型以及痊愈血清中中和抗体水平和交叉中和效能(利用蚀斑减少中和试验测定)四项标准,从10株乙型猪源口蹄疫野毒中选出了4株免疫原性良好的基础病毒。然后采用细胞培养低温继代和化学诱变(以5-FU为诱变剂)两种途径从这四株病毒中培育、分离出17个温度敏感性突变种。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

温度对猪传染性水泡病病毒的杀灭试验

利用不同温度的加温方法,为探求猪水泡病病毒的热致死点,我们进行了本项试验。将试验情况报告如下。 一、材料和方法 (一)试验材料 1.第一次试验:将猪水泡病病毒株湘3号F_(4～6)鼠毒(系第四代、第五代和第六代鼠毒之混合物,每代取死鼠2～3只)做成1:10的无菌浸出液,接种乳鼠。 2.第二次试验:以湘3号毒株F_(5～7)鼠毒(系第五代、第六代和第七代鼠毒之混合物,每代取死鼠2～3只)做成1:20的无菌浸出液,接种乳鼠。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。     

猪传染性水泡病番禺系鼠化弱毒株培育试验

1973年底我们从本省送检的猪水泡病检材中选取对乳鼠适应性较好的番禺县猪水泡病病毒,用2日龄乳鼠直线传代。起初对2日龄的乳鼠不能全部致死,随着传代的代数增加,对乳鼠的适应也增加,直线传至20代时,发现其对猪安全,但免疫原性不够理想,试验猪不能全部抵抗猪水泡病长沙三系强毒的攻击。后改用15代鼠毒进行安效试验,证明有一定的免疫效果。在1976年提高该疫苗的产量研究中,我们制作了全鼠苗,试验证明免疫效果也不错。在中山县、惠州市等地结合控制疫情,进行田间试验,取得满意效果,现将结果报告如下。     

口蹄疫标准抗元和血清的制造与检验

选用500克以上的健康海猪10～20只用继代保存的标准海猪毒以灭菌生理盐水连洗三次,再用灭菌滤纸吸干、秤重,放入消毒乳钵加无菌中性玻璃砂磨碎,用PH7.6的磷酸盐缓冲液制成10％悬浮液,置室温内浸出一小时,每隔10分钟搅拌一次;然后以每分钟3000转离心15分钟,取上清液作为感染材料,在海猪后肢两(足庻)面接种,每(足庻)面皮内注射7～8针,用量约0.2毫升;经18～24小时注射部位形成水泡,然后用生理盐水洗净、采取水泡皮,如上述再制成10％悬浮液,浸出离心,取上清液置于58℃水浴箱内灭能40     

应用反转录-聚合酶链反应检测动物组织中的口蹄疫病毒

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测了猪和牛的扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和蹄冠皮肤中的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）。与接种乳鼠测毒法比较，该方法的灵敏度达０．１６ＬＤ５０～０．３２ＬＤ５０病毒量。检测人工感染后７～３５ｄ的猪组织样品７７份，２５份为阳性；接种乳鼠并盲传３代，乳鼠－间接血凝试验（ＩＨＡ）鉴定６份为阳性。检测人工感染后４～７ｄ的牛组织样品５２份，２０份为阳性；接种乳鼠－ＩＨＡ鉴定１２份为阳性。检测野外鲜肉样品４７份，１２份为阳性；任选其中８份样品接种细胞单层，盲传至第６～７代，先后有５份样品产生ＣＰＥ；其中６份样品同时接种乳鼠，盲传至第６～７代，３组乳鼠出现ＦＭＤＶ致病症状，ＩＨＡ鉴定为阳性。检测冻猪肉样品３７份，３份为阳性；冻牛肉样品９份、冻羊肉样品１０份，均为阴性     

各种血清牛、奶牛、羊接种口蹄疫O、A型弱毒甘油苗后的血清保护试验

全国各地根据需要逐渐开展口蹄疫O、A两型弱毒疫苗的共同注射,节省时间与劳力,为群众所欢迎,但对牛接种后产生抗体如何,未能选定适当条件进行测定。由于农业部兰州兽医药品厂用于生产血清的牛只每隔3～4个月进行一次口蹄疫疫苗预防注射,同时经常进行采血制造血清,便于获得试验血清,故选定该厂牛只进行血清保护试验,测定中和抗体指数。