抗鸡致病性大肠埃希氏菌O_(88)单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌O88 菌株( MG38e) 热灭活抗原免疫BALB/c 雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与SP2/0 细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ELISA 及凝集试验(IHT) 筛选,获得4 株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养液ELISA 和IHT 效价分别为1∶100 ～1∶1000 和3 log2 ～4 log2 ;腹水效价分别为1∶100 ～1∶4000 和4 log2 ～10 log2 。这4 种单克隆抗体( E1 、E2 、E3 、E4) 均能与鉴定的7 株O88菌株发生凝集反应,E4 株还能与O78菌株发生凝集反应。用单克隆抗体对分离的45 株鸡致病性大肠埃希氏菌进行血清型鉴定,结果5 株为O88 ,与用单因子血清鉴定的结果一致。     

鸡源大肠埃希氏菌大质粒的探讨

用碱裂解法提取分离的10株鸡源大肠埃希氏菌的质粒.结果多数大肠埃希氏菌菌株含有大质粒,分子量为50～230kb.这些大质粒可能含有毒力相关基因,与细菌的耐药性、大肠埃希氏菌素的产生及质粒的传递功能等有关.     

鸡源大肠埃希氏菌的分离及生物学特性研究

从福建省几个大肠杆菌病较严重的大型养鸡场分离到的85株大肠埃希氏菌,从致病性试验、生化试验、药敏试验及生物学特性试验结果表明,其中有52株为致病菌,致病菌分离率为61.1%;分离菌株的生化特性符合大肠埃希氏菌的生化特性;所有菌株均能凝集鸡的红细胞,并能被D-甘露糖所抑制;对人、猪、山羊、乳牛、兔、犬、豚鼠、鸽和鱼的红细胞表现为不同的血凝(HA)和D-甘露糖血凝抑制特性;24株强致病菌中有79.2%的表现为盐凝集试验(SAT)阳性所有菌株对丁胺卡那霉素(AKN)和菌必治敏感,对氯霉素(CMP)、先锋霉素(CTN)、卡那霉素(KAN)、呋喃妥因(NI)、氟嗪酸(OFL)、壮观霉素(SPT)、妥布霉素(TOB)、新霉素(NEO)、氟哌酸(NOR)、复合磺胺(SXT)和强力霉素(DOX)有较高敏感性,而对红霉素(ERY)、链霉素(STR)和磺胺异恶唑(SIZ)耐药现象严重.     

鸡大肠埃希氏菌菌毛分类方法的研究

用D-甘露糖敏感血凝特性(MSHA/MRHA)及聚合酶链反应(PCR)扩增2种方法对鸡大肠埃希氏菌菌毛进行分类,证明MSHA/MRHA具有方便、快速及较可靠的特点,但不太敏感;PCR则具有快速、敏感、准确、可靠的优点,用PCR对鸡大肠埃希氏菌进行分类是一种十分有效的新方法.     

辽宁省禽大肠埃希氏菌血清型的调查及其致病性试验

通过病原菌分离、血清型鉴定及本动物致病性试验对辽宁省禽大肠埃希氏菌的主要血清型分布与致病性进行了研究。2001～2005年从该省14个市的病死禽和死胚中分离出大肠埃希氏菌226株,血清型鉴定105株,其中O_(78)型占29．52%(31/105),O_(109)型占10．48%(11/105)。结果,O_(78)、O_(109)血清型是流行于该省致病性禽大肠埃希氏菌的优势血清型。随机选取49株分离菌,以每株1×10~7CFU的量于气管内给6只1日龄SPF鸡接种,根据接种后7 d内死亡和病变的情况,确定高致病株、中度致病株和低致病株,它们分别占75．5%、18．4%和6．1%。结果表明,所有分离菌株均有致病性,并在国内首次分离出禽O_(109)型大肠埃希氏菌。     

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的20株鸡源致病性大肠埃希氏菌进行药敏试验,筛选出13株耐氧氟沙星(OFL)的菌株,进行质粒提取、电泳和转化试验,获得1株由质粒介导的耐OFL多重耐药菌株.该菌株对参试的11种抗生素全部耐药,其中OFLMIC高于50μg/mL.该菌R质粒电泳可见6条带,转化大肠埃希氏菌DH5α在含20 μg/mL OFL的LB平板筛选得到转化子.该转化子含有原菌株中2.7×103b的质粒,获得原菌株部分耐药性.连续转化5次,均获得耐OFL的转化子,证实该菌株对OFL的耐药性由质粒介导.     

间接ELISA检测鸡大肠埃希氏菌菌毛抗体方法的建立

用大肠埃希氏菌O1、O2、O3、O78和O89株制备ELISA抗原,与抗鸡Ig单抗1B7酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接ELISA方法.经交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;确立了将鸡血清100倍稀释检测ELISA效价(ET)的回归方法y=2.453+0.131x(P＞0.05),可用于定量测定.用IH与ELISA方法的比较试验表明,ELISA法比IH法敏感性高4-100倍.     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。     

禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型 ,用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗 ,与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明 ,融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护 ,保护率高达 93%～ 10 0 % ,而O血清型单价疫苗的保护率仅 6 7%～80 % ,双价疫苗的保护率仅 80 %。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明 ,融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。     

211菌对猪致病性大肠埃希氏菌的体外抑制作用

将产乳酸、能生成芽胞的211菌对猪的9株致病性大肠埃希氏菌进行抑制试验.结果表明,培养24～72 h,211菌对9株大肠埃希氏菌均能产生抑制作用,抑菌长度0～3.25 cm;最佳抑菌时间为24～48 h;72 h后抑菌区有不同程度的所缩小,O141和O9菌株抑菌区消失.     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1成熟外膜蛋白H重组亚单位设苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH/BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到OmpmH基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击.结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗.     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH／ BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到Ompm H基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1 进行攻击。结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

鸭源大肠杆菌ZYD_2与多杀性巴氏杆菌YB_2原生质体融合菌株的鉴定分析

以新霉素标记的ZYD2(NEOs)和YB2(NEOr)作为亲本菌株,培育具有双亲本菌株免疫原性的融合菌株。在溶菌酶作用下,制备两亲本菌株原生质体,聚乙二醇4000诱导原生质体发生融合,利用NEO标记及亲本菌株培养条件不同筛选阳性融合子。ZYD2和YB2可分别得到95.32%和95.25%的原生质体制备率以及32.19%和33.52%的再生率。在含新霉素的麦康凯平板上传代培养获得5株稳定遗传的融合菌株。5株融合菌株可同时凝集双亲本菌株的鸭抗阳性血清。染色镜检观察融合菌株为革兰氏阴性中等大小杆菌。利用双重PCR检测,2株检测到双亲本菌株部分外膜蛋白A(OmpA)基因和部分外膜蛋白H(OmpH)基因,2株只检测到部分OmpA基因,另1株检测不到任何条带。测序结果表明检测到的部分基因片段与亲本菌株的相关基因片段同源性为100%。微量凝集反应显示,外周血可以检测到双亲本菌株抗体,抗体效价在二次免疫后可以维持较稳定水平。结果表明获得5株具有双亲本菌株免疫原性且可稳定遗传的融合菌株。     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用,分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3/cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡,首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强,能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明,鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

iss基因与鸡大肠杆菌致病力的关系

为探讨iss基因的存在及其核苷酸序列的差异与鸡大肠杆菌致病力的关系,分别采用普通PCR及套式PCR方法检测iss基因在21株鸡大肠杆菌菌株中的分布,并进行序列测定,分析菌株携带iss基因的情况及不同毒力的菌株间iss基因序列的差异。结果显示,经套式PCR检测21株鸡大肠杆菌均携带iss基因,而普通PCR检测显示仅有13株携带iss基因;16株菌株iss基因与国外禽大肠杆菌iss基因参考序列同源性为100%;其余5株中,E1与参考序列同源性为93.5%,E33、O78与参考序列同源性为99.4%,E4、E21与参考序列同源性为99.7%。推测,iss基因可能在不同来源、不同毒力、不同血清型的鸡大肠杆菌中都普遍存在,仅是拷贝数高低不同,而不是目前普遍认为的"有或无"的关系,并且iss基因序列是高度保守的。iss基因与鸡大肠杆菌致病力的相关性可能与它所定位的质粒拷贝数有关,与iss基因的序列差异无关。     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用

设计了 1对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养 ,然后挑菌做PCR ,同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果 ,从不同省 (市 )的送检病料中分离鉴定出 6 6株多杀性巴氏杆菌 ,PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合 ;该引物对其他 6种猪的常见呼吸道病原菌的扩增结果均为阴性 ;该PCR检测方法能检出CFU为 10 3/mL的巴氏杆菌模板。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。