猪瘟弱毒与鸡新城疫(Ⅰ系)弱毒在同一份猪肾细胞的相互激化作用

从用同一份组培细胞繁殖两种病毒的研究获得结果后,我们又对繁殖过猪瘟弱毒的原代仔猪肾细胞再繁殖鸡新城疫Ⅰ系弱毒进行了研究。我们设想:是否可以在生产猪瘟弱毒疫苗多次收毒后的组培细胞上再生产NDV疫苗。NDV有无促进被猪瘟弱毒感染后的猪肾细     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——疫苗试制、检验、保存及区域试验

自1981年初开展猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究以来,先后完成了一系列基础实验。在1983年试制第1批牛肾细胞苗的基础上,又重复试生产6批苗,经效检,均合乎标准。现将疫苗试制、检验、保存及区域试验结果报告如后。材料与方法(一)种毒 系农业部成都药械厂提供的480代冻干毒和F505代兔脾毒(湿毒),经本室复壮,选择定型热兔脾脏作为种毒,要求毒价不低于2×10~(-5)ID/ml。也可选用5万倍合格的细胞毒做种毒,脾毒和细胞毒以新鲜者为佳。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——以免疫荧光法对猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上繁殖释放过程观察

文献记载,猪瘟病毒的自然感染谱只限于猪属动物。在实验条件下能使不同家畜和实验动物感染,并能在多种动物细胞中繁殖,但在牛肾细胞上的繁殖、释放情况未见报告。设想如能用牛肾细胞培养猪瘟兔化弱毒(以下简称兔毒),并掌握其繁殖释放过程,对研究猪瘟牛肾细胞疫苗将具有重要     

口蹄疫A型细胞组织培养弱毒疫苗、细胞组织培养兔体反应弱毒疫苗的研究——1972年工作总结

对6个半月～7个月及8个半月的免疫持续期试验,我们采用仔猪肾上皮细胞毒120代(病毒滴度=10~(-7.5))又连续适应3～4日龄乳兔三代,乳兔在接种后36～40小时出现典型口蹄疫症状,规律死亡。取其乳兔肌肉组织毒,制10％含毒量的甘油苗(病毒滴度=10~(-7.0)),该疫苗(7102批)在甘肃省成县红川公社、南康公社进行区域实验(该地区从1962年至今未发生过口蹄疫,也未注射过口蹄疫疫苗)。注射黄牛670余头,注苗6个半月～7个月及8个半月分别运回试验牛只,进行强毒攻击。所用强毒为牛源强毒A型44代,病毒滴度=10~(-7.0)     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——猪瘟病毒在牛肾细胞上的培养及影响毒价因素的观察

用免疫荧光法对猪瘟兔化弱毒(以下简称兔毒)在牛肾细胞上繁殖释放过程的研究证明,兔毒虽然能够在牛肾细胞上繁殖释放,但接毒后96小时,感染细胞量仅50％,培养物中毒价甚低。为此,我们对猪瘟兔毒在牛肾细胞上的培养及提高其毒价和影响毒价的因素进行了探讨。     

口蹄疫消毒试验——两种普通杀菌剂对口蹄疫病毒的消毒作用

(一)兰州面碱对O型口蹄疫病毒的消毒作用:根据前一试验报告,5％的兰州面碱在2℃作用2小时,对A型口蹄疫病毒无杀毒效力。为验证前一试验结果,我们重复了试验。用12％的兰州面碱溶液,与等量20％的O型口蹄疫牛舌皮毒(阿克苏牛源毒,于试验室用牛保存28代)悬液均匀混合(混合后,面碱即6％,pH9.6,病毒为10％),于2℃和26℃分别放置30～40、60、120分钟后,接种猪(体重15～20公斤,系A型鸡胚毒效力试验用过     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针,建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来,而不与其他猪源病毒发生非特异反应,分别可检测到初始模板中41.8和81.5个拷贝的病毒RNA,与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近,两种方法对152份样品检测的符合率达96.9%~100%。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测,证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性,可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗免疫程序研究

作者用猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗(以下简称猪瘟犊睾细胞苗)750个对兔感染量(以下简称感染量),在配种前40天至配种后45天内免疫母猪,所产亲代仔猪在20～28日龄时猪瘟间接血凝滴度(IHA)4~×( )占10/32、8~×占11/32、16~×占10/32、32~×占1/32;41～43日龄时,IHA滴度4~×占11/43、8~×占21/43、16~×占9/43、32~×占2/43;在55～58日龄时,IHA滴度4~×占9/33、8~×占17/33、16~×占7/33。用600、760、900、1500个感染量分别给20～28日龄、41～43日龄、55～58日龄仔猪实施免疫,免疫后6～8个月时,监测其抗体水平,结果表明:IHA滴度16~×以上者达100％。750个感染量免疫20～28日龄仔猪组,注苗后持续6个月,IHA滴度32~×以上者达100％;8个月时32~×以上者达87.5％,16~×占12.5％。用猪瘟石门系强毒攻毒,获100％保护。试验首次发现:用猪瘟犊睾细胞苗免疫母猪所产仔猪母源抗体明显低于猪瘟乳兔苗免疫母猪所产仔猪的母源抗体。对猪瘟犊睾细胞苗免疫母猪所产亲代仔猪在20～28日龄用该苗一头剂(750个感染量)进行免疫,8个月之内能抵抗猪瘟感染或强毒攻击,突破了以往认为仔猪用猪瘟乳兔苗免疫应在45日龄以后的常规,为猪瘟犊睾细胞苗的免疫提供了新的免疫程序。     

猪三联苗免疫方法的研究

猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗(简称猪三联苗)系由中国兽药监察所等七个单位组成的科研协作组,以猪瘟兔化弱毒54-Ⅲ毒株、猪丹毒GC42及猪肺疫Eob30弱毒菌株研制而成的细菌和病毒联合的弱毒苗。这是我国首创的疫菌苗之一。经按每头剂含猪瘟150个免疫量,即兔化毒的毒价为10~(-4),实有组织量0.015克、猪丹毒菌5亿、猪肺疫菌3亿计算,以20％铝胶水稀释为每头剂1ml,注射断奶仔猪免疫后,分别攻猪瘟、猪丹毒、猪肺疫强毒,均能达     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——牛肾细胞培养及其生物学性状的观察

用牛肾上皮细胞培养猪瘟兔化弱毒,生长繁殖良好,并不断从细胞中释放出来,猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,不引起肉眼可见病变,用免疫荧光法可在接毒后6小时从胞浆中发现特异性荧光,接毒后18小时,可用家兔在细胞培养物中检出病毒。用带毒细胞传代,能促进兔毒在牛肾细胞上的适应能力,细胞传代后经3个多月培养,其间多次换液,不接毒,细胞收液的病毒滴度可稳定的达到1:20000,用盖玻片作带毒传代细胞单层培养,用姬姆萨染色镜检,可在许多细胞浆中发现原生小体样紫色颗粒,用H·E染色,可在胞浆中发现嗜伊红包涵体样颗粒,初步认为猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,可产生包涵体。用牛肾细胞大瓶旋转培养猪瘟兔化弱毒,能生产疫苗,并可多次接毒、收毒,收毒次数达20余次,疫苗毒价可达1:50000,少数批次可达1:100000,对猪有良好免疫力,本试验1987年10月在云南生药厂已完成中试生产,先后冻干疫苗5批,一次效检50000倍合格的占80％,20000倍合格的占20％,各项检验指标符合规程要求,区域试验注射各种猪只40000余头,证明安全有效,疫苗在-18～-20℃保存1年,未见毒价下降。     

ELISA抗体水平评价口蹄疫灭活疫苗免疫效果的可行性分析

为了探讨免疫抗体评价口蹄疫灭活疫苗效果的可行性,分别用5批次的口蹄疫O型-亚洲1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株)、5批次的猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株+OS/99株)免疫动物,在攻毒的同时采血分离血清,用液相阻断ELISA测定抗体效价,以分析抗体效价与免疫保护的关系。统计学分析表明,二价灭活疫苗的O型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.01),相关系数为0.986;亚洲1型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.05),相关系数为0.997,猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间不呈正相关关系(P>0.05)。结果表明,应用抗体水平评价二价灭活疫苗的免疫效果是完全可行的,但用其评价猪O型灭活疫苗的免疫效果不具有可行性。     

口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。     

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。     

金丝桃素可溶性粉体外抗犬瘟热病毒的试验研究

采用先药后毒、先毒后药和药毒同加3种不同的给药方式,分别在试验开始后第72 h和96 h观察犬瘟热病毒致Vero细胞的病变情况.结果显示,犬瘟热病毒的TCID_(50)为10~(-5.68)/0.1 mL,药物的TC_0为0.312 5 g/L;与对照组比较,药物浓度在0.039～0.312 5 g/L范围内先毒后药方式的细胞生长情况良好,细胞单层完整,视野中有极少量圆细胞或死细胞,而其余两种给药方式的细胞病变明显.结果表明,金丝桃素可溶性粉在先毒后药情况下可以有效抑制犬瘟热病毒的增殖.     

猪瘟兔化弱毒株克隆化的研究

采用终点稀释——纯化染毒细胞的方法对中国株猪瘟兔化弱毒(以下简称C株)种毒进行了3次克隆,最后1次克隆获得10株克隆毒。通过对10株克隆毒的10项病毒学检验,确认这10株克隆毒与种毒的生物学特性基本一致,未发现变异毒株,无杂毒污染。本克隆方法比目前文献上介绍的有关方法更简单实用,在克隆非致细胞病变病毒方面取得一项较好的经验。     

兽医科技简讯

猪瘟兔化弱毒疫苗口服、滴鼻、喷雾免疫试验 (一)材料及方法 1.猪瘟强毒来源:由农林部兽医生物药品监察所供给,石门系干毒,经回归繁殖,作为攻毒使用。攻毒时以新鲜血毒百倍稀释或千倍稀释,每猪1～2毫升。 2.猪瘟弱毒疫苗来源: (1)SFA毒种,由农林部兽医生物药品监察所供给。作为猪瘟口服疫苗免疫的一个新毒种。     

信号肽对O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中表达及分泌的影响

构建融合不同信号肽的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白真核表达载体,筛选不同的分泌型信号肽以提高O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达并使其分泌到CHO培养基中。通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5′端相连,分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western-blot检测CHO培养基中重组表位蛋白累积量,研究结果表明,O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中成功分泌表达,不同的分泌型信号肽明显改变O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO培养基中的累积SCGB1D1 isoform信号肽介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达量最高。综上所述,合适的分泌型信号肽促进O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中的分泌。     

应用单克隆抗体ELISA抑制法检测细胞培养中的猪瘟兔化弱毒

应用2种针对不同抗原决定簇的抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体建立了检测细胞培养中猪瘟兔化弱毒的ELISA抑制试验。对20份不同批次的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞培养物的测定结果表明,该法可较准确地反映病毒在细胞培养中的产量;将病毒培养物置4℃、25℃和37℃3天、超声裂解、冻融3次和6次等不同方法处理对试验结果无显著影响(P>0.05);通过与兔体接种试验比较,探讨分析了猪瘟兔化弱毒疫苗生产工艺中的问题。     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

口蹄疫单层细胞组织培养疫苗的研究——组织细胞苗及组织细胞兔体反应苗(对仔猪)

(一)口蹄疫A型组织细胞苗及组织细胞毒兔体反应苗对50～60日龄杂种断奶仔猪的安全效力试验。 (二)口蹄疫A型组织细胞苗及组织细毒兔体反应苗对10～13日龄杂种哺乳猪的安全试验。 (三)口蹄疫A型组织细胞苗及组织细胞毒兔体反应苗对50～60日龄纯种断奶仔猪的安全效力试验。