鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

旋毛虫P49和P53ES抗原基因的真核表达

将构建的重组质粒pEGFP-N1-P49和pEGFP-N1-P53同时进行双酶切,回收P53基因片段和pEGFP-N1-P49载体,再将P53基因片段重组到pEGFP-N1-P49中,构建旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染后第24小时在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转基因细胞;Western-blot分析证实目的基因的表达产物具有抗原性。结果表明,成功构建了含有旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的定点突变及其对该基因表达的影响

根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计并合成了2对突变引物,对PPV SC-1株VP2基因进行了定点突变.利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建含报告基因EGFP的重组质粒pPI-2.EGFP.VP2(A)、pPI-2.EGFP.VP2(B);利用脂质体介导法将上述重组质粒转染COS-7细胞,从而研究该突变对VP2基因表达的影响.结果显示,成功构建了合突变体及EGFP的真核表达载体;在倒置荧光显微镜下,突变后的质粒转染呈现不同的荧光信号,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品与阳性对照相似,荧光信号均匀分布于细胞中.提示,突变的引入是导致表达差异的主要原因.     

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位

对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。     

口疮病毒ORFV125蛋白抑制宿主细胞凋亡的研究

分析显示,口疮病毒(ORFV)125蛋白的3D结构及其结构域与Bcl-2家族蛋白高度相似。为了探索ORFV125蛋白是否具有Bcl-2蛋白的抑制细胞凋亡作用,本研究通过构建ORFV125基因单个结构域突变体质粒BH1、BH2、BH3、BH4和缺失BH1、BH2、BH3、BH4结构域的突变体质粒,分别将不同质粒分别转染到293T细胞后培养24 h和72 h时通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用。结果,在转染质粒的细胞培养到第24小时的细胞早期凋亡率低于5%,细胞晚期凋亡率低于6%;在转染质粒的细胞培养到第72小时的细胞早期凋亡率高于20%,细胞晚期凋亡率低于4%;而在同一时间点比较,各个的突变体之间的凋亡效果没有显著性差异。以上结果表明,ORFV125蛋白及其突变体具有抑制凋亡的作用,但随着凋亡时间的持续凋亡效果更加明显,这为进一步开展ORFV125蛋白的研究提供了实验基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建微小隐孢子虫类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)基因的真核表达质粒,并在Hela细胞中实现表达,以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,通过PCR扩增CML基因,插入到克隆载体pMD18-T中。对经鉴定的pMD-CML重组质粒进行双酶切,将目的基因连接到经同样内切酶双酶切的真核表达载体pVAX1上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用FuGENE HD转染试剂介导的方法,将重组表达质粒转染Hela细胞,用Western-blot技术和间接免疫荧光法检测外源基因的表达。结果显示,成功构建了微小隐孢子虫CML基因的真核表达质粒pVAX-CML,重组质粒在Hela细胞中实现了表达,表达产物具有良好的反应原性,为研究CML的特性和功能、寻找新的防控技术奠定了基础。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响,构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3.1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3.1-E2-UL49。将pcDNA3.1-E2与pcDNA3.1-E2-UL49分别转染293 T细胞,间接免疫荧光试验结果显示,单独表达E2蛋白的细胞,其荧光主要固缩于核周,而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光;Western-blot分析结果显示,VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达,但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些(P<0.01),表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点突变对蛋白定位及细胞因子水平的影响

为探析猪流感病毒NS1蛋白中影响细胞定位和拮抗干扰素表达的关键氨基酸位点,本研究利用点突变技术扩增A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1突变基因,并构建重组表达质粒pCAGGS-NS1及突变体pCAGGS-NS1_(S42P)、pCAGGS-NS1D_(92E)、pCAGGS-NS1_(S42P/D92E)。将重组真核表达质粒转染细胞,SDS-PAGE和Western-blot均证实NS1蛋白及其突变体蛋白在A549和293T细胞中成功表达。间接免疫荧光试验表明,NS1及其突变体蛋白均主要分布在A549细胞核中,仅有少量分布于细胞浆。此外,试验证明另一株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株的NS1及其突变体蛋白也主要分布于细胞核中,说明点突变不影响SIV NS1蛋白的细胞定位。进一步利用荧光定量PCR和ELISA方法检测A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1点突变蛋白拮抗细胞中干扰素表达的影响,结果表明,pCAGGS-NS1_(S42P)转染组能够明显增强IFN-βmRNA、IFN-αmRNA转录水平(P0.01;0.01P0.05),但对TNF-αmRNA转录水平无明显影响(P0.05)。而pCAGGS-NS1D_(92E)和pCAGGS-NS1S_(42P/D92E_转染组细胞IFN-α、IFN-β和TNF-αmRNA转录水平均无明显变化(P0.05)。试验证实NS1蛋白第42位氨基酸对拮抗宿主细胞中IFN-α/β表达具有重要作用。     

从苏共亡党的教训看中共第四代领导集体的党风廉政策略

中国正处于国内经济体制深化改革、社会结构深刻变动、利益格局深入调整、思想观念深度更新之中，党的作风建设和反腐倡廉工作的长期性、艰巨性、复杂性日益突显出来。在这样的背景下，来重新审视苏共亡党的原因对我国当前的党风廉政实践具有重要的价值。从苏共亡党教训可知，党风廉政建设是立党之本。     

简论苏联干部委任制的形成

苏联的干部委任制始于列宁时期 ,形成于斯大林时期。委任制作为俄国文化的积淀在苏联一定历史时期的存在 ,有其合理性。但是委任制毕竟要被现代社会所抛弃。斯大林非但未能及时进行改革 ,反使之登峰造极 ,最后给后代留下了遗患。     

苏联解体原因研究综述

1917年11月7日,斯莫尔尼宫沸腾的欢呼声向全世界宣布了第一个社会主义国家的诞生;1991年12月25日,镰刀锤头国旗的悄然降落宣告了社会主义苏联从地球上的消失.短短74年转瞬即逝,苏联于一夜之间突然崩塌,让整个世界为之震惊和不解,同时也为中外学者研究这一20世纪的"历史之谜"留下了永恒的课题.     

伊朗巴列维王朝覆灭根源探析

巴列维国王的白色革命动摇了在伊朗乡村长期占统治地位的封建生产关系 ,促进了资本主义生产关系在伊朗的发展。伊朗传统的社会结构也因白色革命的成功推进而发生了激烈变革。经济现代化的长足进步客观上要求政治领域进行相应变革。巴列维无视这些变化 ,继续强化君主专制 ,推行独裁统治 ,致使新兴的社会阶层无权分享政治权力 ,传统的社会力量被摧毁。巴列维国王的独裁统治引起伊朗社会各阶层的普遍不满 ,推翻巴列维王朝成为伊朗社会各阶层共同的战斗目标。因此 ,白色革命后伊朗经济现代化进步趋向与政治领域滞后状态之间的矛盾构成巴列维王朝覆灭的根源     

论苏联失败的经济根源

苏联的崩溃无疑是一种社会性失败,社会性失败必须从经济基础找原因,根本的原因在于苏联的基本经济制度--计划经济制度.苏联计划经济制度的种种弊端实际是这一制度内在的不可克服的矛盾的反映,这一矛盾就是计划的指令性与个人消费的不可计划性之间的矛盾.把社会再生产的各个环节--生产、交换、分配、消费纳入统一计划,是苏联计划经济制度的存在前提.个人消费的选择性特征,决定了个人消费不可能由社会统一计划.由此便形成了否定苏联计划经济存在前提的计划与个人消费的对立.在苏联计划经济制度下,解决这一矛盾的惟一办法是压制个人消费,用供应短缺方式使原本不可能由社会统一计划的个人消费变成可以统一计划的,这实际上并没有消除这种对立.计划与个人消费的对立对社会再生产产生了致命的影响,使社会经济陷入危机循环,而危机积累到一定程度就会以猛烈的形式爆发出来,最终导致经济基础乃至整个苏联社会的崩溃.压制个人消费是苏联计划经济赖以存在的内部条件,与外部世界的制度性隔绝是其存在的外部条件,从长期看这些条件都是难以为继的.     

在拉美所"2006年拉美大选的影响与拉美左派的发展" 研讨会上的讲话

2007年1月11日,“2006年拉美国家大选及其政治走向”课题结项暨拉美大选的影响与左派发展问题研讨会在拉美所召开。中国社会科学院副院长李慎民与会并发表主旨演讲,深刻分析了当前的世界格局和政治走向,拉美左派的发展对该地区形势的影响。现全文发表如下。     

世纪之初俄罗斯经济迅速反弹的原因分析

1999年以来 ,俄罗斯经济走势一改经济转轨以来连续下滑的颓势 ,出现触底反弹并持续增长的积极迹象 ,引起国际社会的广泛关注。这种增长主要的仍是经济严重危机后的恢复性增长 ,由于制约经济增长的结构性因素的存在 ,俄罗斯经济增长的基础并不牢固。从俄罗斯转轨以来的经济走势我们可以看出俄罗斯经济持续好转的原因及经济增长前景 ,这对我国的经济发展是有一定启示的。     

纪念辛亥革命百年为促进祖国统一尽力

1911年（农历辛亥年）,在经过4月广州起义、10月武昌起义之后,爆发了全国规模的辛亥革命。两个月内即有鄂、湘、陕、赣、晋、滇、黔、苏、浙、桂、皖、粤、闽、川等省宣布独立,清政府迅速垮台。12月,孙中山先生出任中华民国临时大总统,成立中华民国临时政府,清帝被迫宣告退位。     

南海局势与应对海洋法的新发展

今年以来,南海局势发生了很大变化。菲律宾国会通过了"领海基线法案",把中国的黄岩岛和南沙群岛部分岛礁划为菲律宾领土;马来西亚前总理巴达维登上南沙群岛的弹丸礁、光星仔礁宣示主权等。这些情况的出现与海洋法的新发展有着密切的联系。因此,如何应对海洋法的新发展就成了捍卫领土主权、维护合法海洋权益的关键。     

东北经济落后原因诸说评析

振兴东北经济必须准确找出其落后的原因。现学术界提出的“结构说”、“体制说”、“国企比重过大说”、“项目怪圈说”及“东北人观念落后说” ,都有一定的合理性 ,但又都不很全面、完整 ,尚有其他原因需加以分析说明。国家在改革、发展战略与政策抉择上“失算” ,使东北地区收入过低 ,人才大量流失 ;在东北改革与发展的关键时期 ,缺乏必要的资金补偿与支持 ,这都是造成东北经济落后的决定性因素。只有全面科学地找出东北经济落后的真正原因 ,才能保证应对方针策略的正确性和有效性。