血管软化丸调控miRNA-467b抗动脉粥样硬化的作用与初步机制研究

目的 探讨中药复方血管软化丸通过miRNA-467b靶向脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LPL）调控巨噬细胞,减少白细胞介素（interleukin,IL）-6,IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等炎症因子分泌和巨噬细胞脂质蓄积,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用与初步机制。方法 将RAW264.7巨噬细胞随机分为5组,即对照组、模型组、miR-467b mimic组、中药高剂量含药血清组、中药低剂量含药血清组;经干预后,采用RT-PCR检测巨噬细胞中pri-miR-467b和LPL mRNA表达;采用高效液相色谱法检测巨噬细胞内胆固醇水平。连续4周高脂饲料（含脂肪21%、胆固醇0.15%）饲养ApoE-/-小鼠复制动脉粥样硬化模型,模型复制成功后,中药高、低剂量组每日分别灌胃血管软化丸86.4、21.6 g/kg,连续给药12周;对照组、模型组每日灌胃0.9%生理盐水86.4 g/kg 。采用免疫组织化学法检测主动脉LPL蛋白表达水平,RT-PCR检测主动脉pri-miR-467b和LPL mRNA表达水平;采用ELISA法检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1水平。结果 与对照组比较,模型组巨噬细胞pri-miR-467b mRNA表达水平和巨噬细胞内游离胆固醇（free cholesterol,FC）水平均明显降低（P＜0.05）,巨噬细胞内LPL mRNA及其蛋白表达水平以及总胆固醇（total cholesterol,TC）、胆固醇酯（cholesterol ester,CE）水平均明显升高（P＜0.05）。血管软化丸能够无剂量依赖性地升高巨噬细胞pri-miR-467b mRNA表达水平和巨噬细胞内FC水平（P＜0.05）,降低巨噬细胞中LPL mRNA及其蛋白表达水平以及TC、CE水平（P＜0.05）。血管软化丸能够升高主动脉pri-miR-467b mRNA表达水平（P＜0.05）,降低主动脉中LPL mRNA及其蛋白表达水平以及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、 MCP-1水平（P＜0.05）。结论 血管软化丸抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用机制可能与调控miRNA-467b靶向LPL调控巨噬细胞,减少IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1等炎症因子分泌和巨噬细胞脂质蓄积相关。     

血管软化丸调控miR-17-5p与PCSK9/VLDLR信号通路抗动脉粥样硬化研究

目的 观察血管软化丸对miR-17-5p及其下游前蛋白转化酶枯草溶菌素（proprotein convertase subtillisin/kexin type 9,PCSK9）/极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor,VLDLR）信号通路的调控作用,揭示血管软化丸抗动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的作用机制。方法 细胞实验：通过加入氧化型低密度脂蛋白构建血管平滑肌细胞损伤模型。根据不同干预方法将细胞分为4组：模型组、miR-17-5p抑制剂组、血管软化丸高剂量含药血清组和低剂量含药血清组;干预后检测各组细胞活性以及细胞miR-17-5p、VLDLR和PCSK9 mRNA和蛋白表达水平。动物实验：根据不同干预方法将小鼠分为模型组、miR-17-5p抑制剂组、血管软化丸高剂量组和低剂量组;干预8周后检测小鼠外周血清中白细胞介素-6 （interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平和小鼠主动脉miR-17-5p、VLDLR和PCSK9表达水平,并观察各组小鼠病理学改变情况。结果 细胞实验：与模型组比较,miR-17-5p抑制剂组,血管软化丸高、低剂量含药血清组血管平滑肌细胞活性均明显升高（P<0.05）,血管平滑肌细胞的miR-17-5p和VLDLR mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）,血管平滑肌细胞的PCSK9 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。动物实验：与模型组比较,miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组外周血清中IL-6、TNF-α水平均明显降低（P<0.05）,血清中IL-10水平均明显升高（P<0.05）,主动脉miR-17-5p和VLDLR mRNA水平均明显降低（P<0.05）,PCSK9 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;病理学观察发现模型组小鼠主动脉管径厚薄不均匀,内膜不光滑,管腔内可见明显AS斑块形成,斑块内可见浅染无定形物和钙化颗粒物,部分AS斑块截面积大于主动脉截面积。miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组AS病变程度明显较模型组减轻。     

加减薯蓣丸对血管性痴呆模型大鼠海马区GSK-3β Cyclin D1表达的影响

目的 观察加减薯蓣丸对血管性痴呆（vascular dementia,VD）模型大鼠海马区糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达的影响,探讨其防治VD的机制。方法 将40只SPF级雄性Wistar大鼠分为正常组、模型组、西药组和中药组,每组10只。采用改良双侧颈总动脉结扎法复制VD模型。中药组、西药组分别给予加减薯蓣丸、尼莫地平灌胃,正常组和模型组均给予生理盐水灌胃,均连续灌胃6周。光镜下观察大鼠海马神经细胞的组织形态学变化,Western-blot法检测海马区GSK-3β表达水平,免疫荧光法检测海马区Cyclin D1表达水平。结果 光镜下可见中药组、西药组VD大鼠海马神经细胞病变较模型组明显减轻。Western blot和荧光免疫法显示,中药组、西药组VD大鼠海马区GSK-3β水平较模型组显著降低（P<0.05）,海马区Cyclin D1表达水平较模型组明显升高（P<0.05）;中药组与西药组GSK-3β、Cyclin D1表达水平比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 加减薯蓣丸可能通过激活Akt通路抑制GSK-3β表达,上调Cyclin D1表达,从而保护VD大鼠海马神经细胞。     

基于HIF-1α-VEGF-EPO信号通路探究电针干预大脑中动脉栓塞大鼠脑血管新生的机制

目的 基于低氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF）-1α-血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）-促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）通路探究电针“百会”“水沟”“足三里”“曲池”治疗脑缺血的作用机制。方法 将108只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组。采用线栓法复制右侧大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型。电针组于模型复制后4 h电针“百会”“水沟”和左侧“后三里”（“足三里”）、“曲池”,疏密波,频率5～100 Hz,每次20 min,每日1次,治疗14 d。假手术组、模型组同等抓取固定,不进行治疗。采用改良神经功能缺损体征评分（modified neurological severity scores,mNSS）评价大鼠神经功能损害情况,多普勒超声检测缺血半暗带区局部脑血流量（regional cerebral blood flow,rCBF）变化,HE染色观察脑缺血半暗带病理学改变,免疫组织化学法检测缺血半暗带区皮质CD34阳性细胞数,Western blot 法和RT-PCR法分别检测缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO蛋白及其mRNA表达水平。结果 与同时点假手术组比较,模型组大鼠mNSS、CD34阳性细胞数、HIF-1α、VEGF、EPO蛋白和mRNA表达水平均显著增加（P＜0.05）,rCBF显著减少（P＜0.05）,HE染色可见大量神经元坏死;与同时点模型组比较,电针组大鼠mNSS评分显著减少（P＜0.05）,rCBF、CD34阳性细胞数及HIF-1α、VEGF、EPO蛋白和mRNA表达水平均显著增加（P＜0.05）,脑缺血半暗带区病理学改变均有所好转。结论 电针“百会”“水沟”“足三里”“曲池”能激活HIF-1α-VEGF-EPO通路蛋白和基因表达,增加CD34阳性细胞数量,介导内皮细胞血管新生,从而提高MCAO大鼠rCBF,改善脑组织结构和功能,且治疗效果具有时间累积效应。     

丹皮酚对脂多糖诱导的大鼠血管内皮细胞VCAM-1、TNF-α释放及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的观察丹皮酚(Paeonol,Pae)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)释放血管内皮细胞黏附因子-1(vascular endothelial cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及Toll样受体-4(toll-like receptor,TLR4)/核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的影响,以阐明Pae抑制VECs黏附功能的分子机制。方法组织块预消化贴壁法分离培养VECs,采用LPS诱导VECs炎性损伤;健康大鼠灌胃给予Pae制备含药血清,反相高效液相色谱法测定血清Pae的含量;RT-PCR法检测TLR4mRNA的表达;凝胶迁移试验检测NF-κB蛋白的表达;免疫组织化学检测VCAM-1的表达;放射免疫法检测TNF-α的表达。结果 Pae含药血清(2.5,5,10μg/mL)作用于LPS诱导的VECs 24h,可抑制VECs中TLR4mRNA和NF-κB蛋白表达,以及VCAM-1和TNF-α分泌,呈现一定的剂量依赖性,其中Pae 10μg/mL的抑制作用均具有统计学意义(P0.05)。结论 Pae降低TNF-α的释放和VCAM-1水平,可能是通过下调LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路的活化而实现的。