微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建微小隐孢子虫类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)基因的真核表达质粒,并在Hela细胞中实现表达,以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,通过PCR扩增CML基因,插入到克隆载体pMD18-T中。对经鉴定的pMD-CML重组质粒进行双酶切,将目的基因连接到经同样内切酶双酶切的真核表达载体pVAX1上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用FuGENE HD转染试剂介导的方法,将重组表达质粒转染Hela细胞,用Western-blot技术和间接免疫荧光法检测外源基因的表达。结果显示,成功构建了微小隐孢子虫CML基因的真核表达质粒pVAX-CML,重组质粒在Hela细胞中实现了表达,表达产物具有良好的反应原性,为研究CML的特性和功能、寻找新的防控技术奠定了基础。     

隐孢子虫鼠基因型CP15基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建隐孢子虫鼠基因型CP15基因的重组真核表达质粒,检测其重组质粒在Hela细胞中的表达。采用PCR方法,从pMD18-T-CP15菌液中扩增了CP15及含寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的CP15基因,酶切测序鉴定;将该基因亚克隆至pVAX1载体中,用脂质体介导的方法转染Hela细胞,RT-PCR法、间接免疫荧光法和Western-blot法检测表达蛋白的生物学活性。结果显示,扩增了约360 bp和380 bp的隐孢子虫鼠基因型CP15和含CpG-ODN的CP15基因,酶切测序鉴定成功构建了pVAX1-CP15和含有CpG-ODN的重组真核表达质粒pVAX1-C-CP15。转染Hela细胞后,用RT-PCR法检测到外源基因有效的转录,用间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot法检测到外源基因的有效表达。结果表明,构建的重组真核表达质粒能够在Hela细胞中成功转录和表达,并且表达产物具有良好的免疫活性。这为下一步深入研制具有高保护性的隐孢子虫核酸疫苗奠定了基础。     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1( )真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1( )ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

口蹄疫病毒O/China/99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶单因子血清的制备

为获得特异性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单因子血清,根据GenBank中A/Chicken/Zhejiang/SD007/2013毒株的序列人工合成了HA基因和NA基因,然后将其分别克隆至真核表达载体pCAGGS,构建了重组真核表达质粒pCAGGS-HA和pCAGGS-NA,经酶切和测序鉴定后将阳性重组质粒转染COS-7细胞,利用H7N9AIV鸡血清进行Western-blot分析。结果显示,重组质粒中的目的基因均能够成功表达。将重组质粒以每只200μg的剂量免疫4周龄SPF鸡,二免后第14天采集血清并用间接免疫荧光试验和Western-blot检测抗体。结果显示,免疫鸡产生的血清均能与对应质粒经COS-7细胞表达的蛋白发生特异性反应。结果表明,成功制备的H7N9AIV HA蛋白和NA蛋白单因子血清具有良好的反应原性,为提高H7N9AIV的血清学检测方法的准确性提供了一定技术支撑。     

H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达

采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang-dong/1/96(H5N1)株的核蛋白(NP)基因,将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX-NP阳性克隆转染Hela细胞,48 h后经间接免疫荧光试验和Western-blotting检测,NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57 ku,它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。     

表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150中,获得重组质粒pTS2GFPV150-F。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组,挑取表达增强型绿色荧光蛋白的噬斑,经多轮筛选获得重组病毒rFPV-F,应用PCR、RT-PCR、Western-blot等方法对重组鸡痘病毒进行鉴定。结果显示,成功获得NDV F基因及重组F基因的鸡痘病毒rFPV-F,并证实F基因已被整合到鸡痘病毒基因组中,且在感染细胞内被成功表达。本研究成功获得了1株表达NDV F基因的重组鸡痘病毒,为下一步开展动物体内免疫研究奠定了基础。     

携带猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建可有效抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)入侵的诱导黏膜免疫反应的核酸疫苗,采用RTPCR方法扩增了PEDV SC-L株的S基因主要抗原编码区域(简称S1),插入pMD19-T载体,构建载体pMD19-T-S1,再将S1基因片段插入双启动子真核表达载体pVAXD中,构建了pVAXD-S1表达载体。经免疫荧光法鉴定S1基因可在COS-7细胞中正常表达后,将pVAXD-S1电转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,构建了携带S1基因的重组减毒沙门菌SL7207(pVAXD-S1),并对该重组菌株的生长曲线、携带质粒的稳定性、口服小鼠的安全性及目的基因在体内转录等特性进行了鉴定。结果显示,SL7207(pVAXD-S1)在含卡那霉素(100μg/mL)的培养环境中稳定性良好,以每只1×109 CFU口服免疫BALB/c小鼠具有良好的安全性,携带的S1基因能在小鼠回肠末端组织内正常转录及表达。本研究为深入开展减毒沙门菌疫苗菌株SL7207(pVAXD-S1)的免疫评价及构建PEDV与其他抗原基因联合免疫DNA疫苗奠定了基础。     

鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白(ChPrP),根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G+C含量等特点对目的基因PrP(25~248)进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP(25~248),并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因鉴定

为鉴定鸡白痢沙门菌生物被膜形成不依赖Rpo S的调控基因,以鸡白痢沙门菌S6702及其rpoS基因缺失株S6702ΔrpoS为母本,对S6702生物被膜状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7BF vs S7SBF）及S6702ΔrpoS浮游状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7SFY vs S7SBF）进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,构建基因缺失株并验证其生物被膜形成能力。结果显示,S7BF vs S7SBF组共鉴定出83个差异表达基因,S7SFY vs S7SBF组共鉴定出1 984个差异表达基因,筛选出15个可能与生物被膜形成相关的基因。以STM2361和STM1703为靶标构建基因缺失株,结晶紫染色定量结果显示,STM2361不影响鸡白痢沙门菌生物被膜的形成,而STM1703缺失能增强鸡白痢沙门菌的生物被膜形成能力。本研究鉴定出不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成调控基因,丰富了鸡白痢沙门菌生物被膜调控的信息。     

长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选

为了筛选副鸡嗜血杆菌的体内表达基因,提取了副鸡嗜血杆菌的全基因组,构建了副鸡嗜血杆菌基因组的pET系统表达文库。运用PCR及核酸内切酶(SalⅠ+NdeⅠ)鉴定基因文库,并以病原菌吸附后的康复血清作为探针,采用菌落原位杂交的方法对基因文库进行筛选。结果显示,重组质粒中有0.5～2kb的片段插入,99%的基因包含在基因文库中;重复筛选后得到的阳性克隆再经过PCR与SalⅠ+NdeⅠ酶切鉴定后定向测序,并对测序结果在NCBI上进行分析后发现筛选获得的基因中,有1个表达为转运谷氨酰还原酶、1个表达为转录终止因子,1个表达为荚膜合成域2,还有2个表达为保守假想蛋白。结果表明,本研究应用体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选到了一些副鸡嗜血杆菌体内诱导表达基因,并对基因的功能做了初步探讨,在找寻副鸡嗜血杆菌在体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为传染性鼻炎的预防和治疗积累了有价值的资料。     

Ea3-1E与mChIL-15融合基因的构建及其真核表达质粒的免疫效果

应用重叠扩增PCR技术将鸡堆形艾美球虫子孢子表面抗原3-1E基因片段(Ea3-1E)与编码鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL-15)进行串联连接,并在这2个基因片段之间引入4个柔性连接肽SPGS,获得融合基因Ea3-1E-linker-mChIL-15。以pcDNA3.1(+)为载体构建并鉴定真核表达质粒pcD-NA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15。应用磷酸钙法将质粒体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。将重组质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15、pcDNA3.1-Ea3-1E和pcDNA3.1分别于14和21日龄经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄时,除非免疫非感染组外,各组感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒的免疫保护效果。结果显示,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后第30小时可检测到融合基因编码蛋白在293T细胞中的瞬时表达。与质粒pcDNA3.1-Ea3-1E相比,质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15二次免疫后可提供明显的抗球虫免疫保护效果,提高相对增重率(96.48%),降低卵囊排出率(68.35%),降低十二指肠病变记分等。抗球虫指数为183.78。     

腔上囊病病毒VP2基因重组腺病毒的构建

采用RT-PCR方法扩增腔上囊病病毒(IBDV)VP2 基因,亚克隆到 pAdlox转移载体,与野生型腺病毒ψ5一起共转染Cre8细胞,将IBDV-VP2基因在5型腺病毒中进行表达。结果,获得了含有腔上囊病病毒 VP2 基因的重组腺病毒 Adv VP2,感染重组腺病毒的细胞经 Western blotting检测,得到了1个约37 ku的VP2多肽,而感染空载体病毒的细胞及对照细胞则无此蛋白条带。证实,成功构建了表达IBDV VP2基因的重组腺病毒。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。