应用萤光抗体法诊断猪瘟

目前许多国家,已应用萤光抗体法诊断猪瘟。这是一种特异性较高、并具有实用价值的诊断方法。日本应用的萤光抗体法分为两种:一种是从病猪脏器采取组织(最好是扁桃腺)涂抹标本或在冻结切片标本上进行萤光抗体染色;另一种是采取病猪的脾和扁桃组织作成乳剂接种子猪肾细胞,在1～2天内进行细胞染色。这两种方法,被广泛应用的是第二种,一般被称做组织培养萤光抗体法,主要是用培养细胞进行诊断。这种方法易于鉴别,准确性高,     

用萤光抗体法检验猪传染性水泡病肉尸带毒的研究

用一般方法生产的高免猪血清制造的萤光抗体液,经两次生产试验检定,能显示病猪和注射疫苗后发病猪淋巴结印片中含特异性抗原的免疫细胞,单检查腘淋巴结的检出率为89％,股前淋巴结为95％,综合判定这两个淋巴结的检查结果,检出率达到98％。检查非疫区健康猪则可能有24％枉检。检查高免猪全为阴性。这些结果表明,此种萤光抗体液有较大的效力和有特异性。     

用补体结合和萤光抗体标记法实验室诊断猪水泡病

对猪的一种水泡性疾病的起因予以迅速鉴定是人们所希望的,这将可以尽快履行或撤销适用于或者口蹄疫(FMD)或者猪水泡病(SVD)的控制措施。补体结合实验(CFT)已应用于这两种疾病的诊断,但是用上皮样品直接试验如欲成功,病毒抗原必须大量存在。常常需要将材料在组织培养上继代,这可能延迟诊断达一天或更长一些。     

用萤光抗体技术迅速查证水泡上皮中的猪水泡病病毒

曾经运用萤光抗体技术侦查用一定日龄的病损的水泡上皮悬浮液接种的组织培养中的病毒。用5日龄以下的水泡于3小时后便获得阳性结果,用6至10日龄的病损材料于3至5小时后获得阳性结果。水泡上皮的感染力在1日龄的水泡均为每克10~(10)产斑单位,到10日龄的病损即降至每克10~(6·9)产斑单位。     

用间接ELISA法检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法 ,用该法检测 2 0份人工感染鸡血清样品 ,抗体阳性率为 10 0 % ,康复期鸡群血清抗体阳性率为 4 3% ,人工接种弱毒疫苗 6 5d和 170d鸡群血清抗体的阳性率分别为 6 0 %、70 %。经反复试验 ,确定了诊断抗原的制备方法和间接ELISA检测鸡痘抗体的最佳反应条件 ,即抗原包被浓度 10 .8μg/孔 ,待测血清最佳稀释度为 1∶10 0。     

用抗体连接法可生产疫苗

一种新的技术不久将可使研究人员生产一些特制的疫苗。这种方法可从病毒中分离出刺激免疫反应的特殊蛋白,并使它们在免疫动物体内诱导出高效免疫反应。St Andrew大学Rick Randall和DanYoung正在研制这种新型疫苗。起点是一个固体颗粒,约一个细菌大小,将这种固体基质与单克隆抗体连接,这种抗体是与单一抗原结合的提纯抗     

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsa_(m4)。将Gcsa_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsa_(m4)。利用Western-blot检测rcsa_(m4)与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsa_(m4)与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsa_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsa_(m4)主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85μg/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×10~3μg/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsa_(m4)后,每毫升的一免兔血清可中和50～70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsa_(m4)在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体p ET-30(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsam4。利用Western-blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsam4与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsam4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsam4主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85 g/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×103g/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsam4后,每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

截短腐败梭菌α毒素的表达及其免疫原性评价

为了获得截短腐败梭菌α毒素并评价其毒性、反应原性和免疫原性,根据腐败梭菌α毒素的结构与功能,设计2对引物分别扩增含有穿孔活性区和受体结合区的α毒素基因csaN和csaC,克隆至pET-28a(+)质粒,构建截短α毒素表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导csaN和csaC表达,鉴定产物的反应原性和毒性,将经过诱导表达的工程菌灭活制成铝佐剂疫苗免疫家兔1次,通过血清中和试验和攻毒保护试验评价免疫效力,设立重组α全毒素rcsa免疫组作为阳性对照。结果显示,2个截短α毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中均获得表达,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清发生特异性反应,但失去了小鼠致死毒性。免疫家兔血清中和试验结果显示,csaN组血清的中和效价为1 MLD/0.1 mL,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015年版)》效力检验的最低标准,csaC组为0,rcsa组为8 MLD/0.1 mL;csaN和csaC组家兔用1 MLD毒素攻击均未获得保护,而rcsa组家兔4/4获得保护。结果表明,截短α毒素与全毒素相比,失去了毒性但保留了反应原性,仅含穿孔活性结构区的截短部分具有较弱的免疫原性。     

泰勒焦虫病的免疫萤光法

萤光抗体法作为一种保证在短时间内得到准确结果的具有高度敏感性和特异性的方法,目前已为大家所公认。 为了用免疫萤光法研究原虫,首先采用间接法来发现抗原。M.Ristic,W.R.Pritchard二氏(1959),P.A.Madden氏(1962)利用这种方法,研究了在实践感染动物的血液涂片中查出边虫的可能性。结果发现,寄生虫发淡黄——绿色的萤光,并很容     

用间接ELISA法检测鼠血清MDV抗体

１９７１年,瑞典的Ｅｎｇｖａｌ等和荷兰的ＶａｎＷｅｅｍａｎ等建立了酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）。２０多年来,该法已发展成为常１）黑龙江省鹤岗市畜牧局兽医卫生防疫站中图分类号Ｓ８５２．５收稿日期１９９８－１２－１６规检测法,其检测范围不仅包括感染性...     

提高C型肉毒梭菌菌苗效力的研究——C型肉毒梭菌的透析培养法

Sterne和Wentzel于1950年,在50升玻璃瓶内,采用透析囊进行C型肉毒梭菌透析培养,制备透析毒素韵毒力为200万MLD/毫升,比常法增加20倍。Vinet和Raynaud于1964年,改进了培养方法,使C型肉毒梭菌透析毒素毒力提高到200～400万MLD/毫升,在南非用此法,每年生产C、D型肉毒梭菌类毒素300～500万头份免疫量。目前国内C型肉毒梭菌苗,仍以常法生产,存在着不易生长、产毒能力低、抗原纯度差和免疫剂量大等问题。自1982年以来,我们先后采用实验玻璃瓶与自行设计的透析培养器(青透型培养器)进行培养试验,已取得了制备透析菌液的初步经验,现报告如下。     

用ELISA双抗体夹心法快速检验肉品污染的沙门氏菌

随着肉品生产的迅速发展,肉品污染沙门氏菌引起食物中毒的机会相对增多。但目前肉品污染沙门氏菌的检测方法仍用经典的常规分离培养法,费时(需4～6日)、费力,远不能适应当前肉品生产与销售对防污染监测的需要。为了改变这一状况,国内外有人报道,用沙门氏菌增菌培养物作为包被抗原的ELISA方法。笔者曾模拟了朱培坤等(1985)介绍的被检样品经沙门氏菌增菌培养后可直接作为包被抗原的ELISA检测方法,结果这种方法难以克服增菌液中其它杂蛋白的非特异性吸附,影响反应的特异性和灵敏度。在本试验中,我们用ELISA双抗体夹心法快速检测肉品中污染的沙门氏菌,获得满意结果。     

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1 m L剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1 MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45 MLD/0.1 m L,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5 MLD/0.1 m L;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。     

用间接血凝反应检测猪瘟抗体的研究

间接血凝是一种快速、灵敏、简单、可靠的血清学方法,我国兽医界,近年来已逐步应用于畜禽传染病,寄生虫病的诊断方面。笔者于1982年对这一方法进行了探索,以用作检测猪瘟抗体,当的所用抗原,系以石门系猪瘟强毒接种健康猪,采发病典型猪的淋、脾,将其磨碎冻融,浸出液经浓缩后作为抗原,致敏绵羊红细胞以检测猪瘟抗体,曾获得成功。但因来源有限,后乃改用牛肾细胞猪瘟毒作抗原,现将其试验情总结如下。     

魏氏梭菌病四联浓缩灭活疫苗免疫动物血清抗体测定

魏氏梭菌病四联浓缩灭活疫苗免疫动物血清抗体测定马乐英杨爱玲吕红蒋祯罗显驿（农业部兰州生物药厂７３００４６）为检验兰州生物药厂研制的浓缩魏氏梭菌病即产气荚膜梭菌病四联灭活疫苗的免疫效果，我们抽检中试生产的若干批疫苗免疫黄牛、家兔和绵羊，用小白鼠测定了血...     

产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4～5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

用反向间接血凝抑制法检测鸡传染性法氏囊病血清抗体

用反向间接血凝抑制法检测鸡传染性法氏囊病血清抗体黄建生樊晓京朱益群（江苏省启东市畜牧兽医站２２６２００）笔者利用江苏农学院畜禽病原微生物研究室提供的鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）单克隆抗体致敏的红细胞，应用反向间接血凝抑制试验（ＲＰＨＩ）检测ＩＢＤ血清抗...     

产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA方法的建立

为建立绵羊产气荚膜梭菌ε毒素抗体间接ELISA检测方法,对D型产气荚膜梭菌（C60-1株）的ε毒素基因进行扩增,构建pET-32a-ε重组质粒,转入BL21(DE3)PlysS诱导蛋白表达,经Ni柱纯化后获得可溶性ε毒素重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和临床检测中的应用进行验证。结果显示,重组蛋白包被浓度为0.5μg/m L,封闭液为1%BSA,待检绵羊血清1∶100稀释,家兔抗山羊HRP酶标二抗1∶5 000稀释,显色液避光显色20 min为最佳反应条件。测定45份阴性血清,计算其平均值（X）和标准差（SD）,确定所建立的ε毒素抗体间接ELISA方法的阴阳性临界值（X+3SD）为0.254。检测阳性血清敏感度为1∶3 200,批间和批内重复率显示,变异系数均小于10%,特异性试验显示,检测羊痘病毒（SPV）、蓝舌病病毒（BTV）、羊布鲁氏菌、沙门菌和绵羊肺炎支原体均没有特异性反应。检测90份临床羊血清样品,该间接ELISA方法与商品化试剂盒之间的阳性符合率为82.9%,阴性符合率为95%,总符合率为85.6%。结...