猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上,成功构建重组表达质粒pET5-ORF6.将其转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经IPTG诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的26.8%,采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测,结果表明表达的蛋白显示特异性.     

猪圆环病毒2型ORF4基因编码蛋白的体外表达

为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了ORF4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-ORF4原核表达载体和pEGFP-C2-ORF4真核表达载体.序列分析、SDS-PAGE分析和Western-blot检测表明,PCV-2 ORF4基因长180 bp,共编码60个氨基酸;其编码蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子质量大小约为6.685 ku.真核PK15细胞的转染试验显示,ORF4重组蛋白在PK15细胞的细胞核和细胞浆中均有表达,但对其有一定的毒性.     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段,将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明,糖蛋白gD基因去信号肽片段长1 155 bp,与PRV Fa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol/L IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5α中均得到表达,其中在宿主菌XL1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示,大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的优化表达及活性检测

通过软件分析后,截去猪圆环病毒2型ORF2基因中影响蛋白表达的保守基因,并对其余的基因进行了密码子优化。把改造后的ORF2基因连接到pGEX-4T-1载体上并转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出分子质量为50ku的重组蛋白,在0.2mmol/L的IPTG诱导5h情况下表达效果最好,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经琼脂糖凝胶纯化可得到较纯的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能刺激小鼠产生相应抗体,并能与PCV2阳性血清进行特异性免疫印迹反应。试验结果证实表达的蛋白具有良好的抗原性。     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

用猪源出血性大肠埃希氏菌灭活菌苗预防猪内毒素性休克

从当地分离的9株猪源出血性大肠埃希氏菌(EHEC)分别制成类毒素菌苗和铝胶菌苗,分别于14日龄免疫长×荣猪,每组4头,1.0 mL/头,并于28日龄时二免,2.0 mL/头,同时设4头注射生理盐水对照组,于48日龄时按1.0 mL/kg体重静脉注射经超声波处理的EHEC裂解物.结果类毒素免疫组猪与对照组猪均发生呕吐、腹泻,于12-24 h死亡;菌苗组猪仅发生一过性呕吐和腹泻.试验结果表明,EHEC菌苗对猪内毒素性休克有预防作用.     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

211菌对猪致病性大肠埃希氏菌的体外抑制作用

将产乳酸、能生成芽胞的211菌对猪的9株致病性大肠埃希氏菌进行抑制试验.结果表明,培养24～72 h,211菌对9株大肠埃希氏菌均能产生抑制作用,抑菌长度0～3.25 cm;最佳抑菌时间为24～48 h;72 h后抑菌区有不同程度的所缩小,O141和O9菌株抑菌区消失.     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象,通过EA花环试验测定Fc受体数目,通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示,在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡,表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后第3 d明显下降,第7 d有所回升,之后基本恢复,表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。