CVN重组蛋白体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

本研究以Gen Bank中蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)基因序列(DQ668406.1)为基础,合成CVN基因,构建表达质粒pMAL-c5x-CVN,通过优化诱导条件,表达出可溶性CVN重组蛋白。利用cck8试剂盒检测CVN重组蛋白对Marc-145细胞的毒性,并在安全浓度范围内进行了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)试验。在PRRSV感染Marc-145细胞的吸附、穿入和复制三个阶段进行检测,探究CVN体外抗PRRSV的作用效果。各阶段的病毒TCID_(50)检测、间接免疫荧光试验以及qPCR测定结果表明,CVN在PRRSV感染宿主细胞过程中的入侵阶段发挥阻断作用,而在病毒吸附细胞和在细胞内复制的阶段没有抑制效果。本研究为新型抗PRRSV药物的研发奠定了试验基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒的提纯和鉴定

取鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）患鸡的法氏囊病料经氟利昂作用去除杂蛋白，并经甘油一酒石酸钾密度梯度离心进一步纯化；细胞适应毒在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上出现明显细胞病变后冻融、ＰＥＧ沉淀纯化。电镜观察、吸光庆测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）的结果表明，得到了完整形态的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。     

鸡传染性法氏囊病不同组织灭活油乳剂苗免疫效果试验

鸡传染性法氏囊病不同组织灭活油乳剂苗免疫效果试验杨峻，邵华斌，黎秋华，杨年娣，甘伏生（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武昌４３０２０９）本试验应用鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）湖北省地方毒株（ＨＢ＿９０９）通过人工感染鸡的法氏囊、感染鸡胚和鸡胚囊液制...     

鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫鸡中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系

为了探讨鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系,以不同剂量的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗免疫21日龄的SPF鸡,免疫后采血测定鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体,并用传染性法氏囊病病毒强毒攻击,攻毒后第72小时,剖检所有试验鸡,观察鸡法氏囊等器官病变。将每只试验鸡的传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护情况进行一一对照。结果显示,当传染性法氏囊病病毒的中和抗体效价≥1∶16 384(214)时,可获得100%的保护;效价为1∶8 192(213)时,保护率为95.5%;效价为1∶4 096(212)时,保护率为92.9%;效价为1∶2 048(211)时,保护率为86.1%;效价为1∶1 024(210)时,保护率为76.5%;效价为1∶512(29)时,保护率为53.3%;效价为1∶256(28)时,保护率为33.3%,效价≤1∶128(27)时,保护率为0。试验证明,鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力密切相关。     

麻雀体内传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及理化特性研究

从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）阳性麻雀体内分离到了一株病毒，用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验和ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针斑点杂交试验证明该病毒为ＩＢＤＶ。病毒可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。病毒血清型鉴定为Ⅰ型，病毒代谢抑制试验证明其基因组为ＲＮＡ，病毒核酸的电泳图谱呈两条特征带。病毒对乙醚不敏感，ｐＨ２．０不能灭活病毒，ｐＨ１２可使病毒失去感染性，５６℃作用３小时病毒仍有活性，７０℃１小时可灭活病毒。以上结果表明从麻雀体内分离到的ＩＢＤＶ理化性质比较稳定，与目前鸡场流行的ＩＢＤＶ极为相似，可能与鸡ＩＢＤＶ同源，提示麻雀可能在ＩＢＤ流行病学中起主要作用。     

传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备及其抗病毒活性的分析

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。用间接免疫荧光试验和病毒中和试验分别测定McAb的特异性和抗病毒活性,杂交瘤细胞株2C8分泌的McAb具有较高的抗IBDV活性,培养上清液中的抗体中和效价为210,诱生BALB/c小鼠腹水中的抗体中和效价达到107,抗体亚类为IgG1κ。将2C8-McAb制成注射液,经肌肉注射,在12h内,鸡血液循环中的鼠源McAb达到高峰,半衰期至少可持续14d。在IBD预防试验中,注射2C8-McAb的鸡可抵抗IBDV强毒感染。在IBD治疗试验中,对IBDV强毒感染发病鸡用2C8-McAb治疗,存活率为60%(18/30),第21天检测法氏囊组织IBDV全部为阴性;而非治疗对照组,发病鸡的存活率只有20%(6/30),第21天检测存活鸡法氏囊组织IBDV全部呈阳性。本试验结果表明,高中和活性的2C8-McAb对IBD具有良好的预防及治疗效果,能够显著降低死亡率,并且McAb治疗康复鸡不带毒。     

表达流行毒株VP2蛋白的IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2的构建及其免疫效力的评价

为应对传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异毒株及超强毒株(vvIBDV)等突发疫情的出现,解决传统疫苗株筛选费时费力的难题,在流行病学调查的基础上,克隆了超强毒株HLJ0504的VP2基因,并突变细胞嗜性决定氨基酸位点(Q253H/A284T),用其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,成功获得1株表达流行vvIBDV VP2蛋白的重组病毒rGtHLJVP2。体内、外复制动力学研究表明,该重组病毒与亲本病毒Gt的复制能力相当。动物试验结果表明,该重组病毒对接种鸡无明显致病性,接种鸡法氏囊指数均在0.7以上,法氏囊无明显萎缩现象。该重组病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答,其抗体水平明显高于亲本毒,能够完全抵抗vvIBDV的攻击。另外,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究结果为新型传染性法氏囊病疫苗的研发奠定了基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重要意义。     

脂肪酸合成酶抑制剂C75对日本脑炎病毒感染力的影响

为初步探究宿主细胞脂肪酸合成酶(FASN)在日本脑炎病毒(JEV)感染细胞过程中的作用机制,采用FASN的特异性酶活性抑制剂C75进行体外和体内试验,观察其对病毒感染力的影响。分别以不同浓度的C75(0、10、20μmol/L)作用细胞,通过噬斑试验检测病毒量,Western-blot检测E蛋白的表达量,Q-PCR检测病毒NS1mRNA的表达水平,激光共聚焦试验观察病毒蛋白与FASN的位置关系,体内抗病毒试验验证C75的抗病毒效果。结果显示,在体内、外试验中,C75抑制FASN酶活性后,JEV的感染量均下降;FASN与JEV的NS3、NS5蛋白以及病毒RNA均存在共定位现象。结果表明,FASN在JEV感染时起重要作用,且C75在体内外均具有抗JEV感染的作用。     

鸡IBD各脏器组织含毒量的测定

笔者为了采IBD(传染性法氏囊病)发病鸡的组织,制造当地野毒株的灭活疫苗,对IBD发病或死亡鸡用琼脂免疫双扩散试验测定了各脏器组织的含毒量。发现只有鸡的法氏囊组织中能直接检出病毒抗原,其他组织中均不能直接检出。材料与方法 ①病料:从临诊病例中,通过流行病学调查,临症检查和剖检变化符合IBD的76只鸡采集心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肌肉、脑、脊髓、法氏囊和肠管等11种器官组织。②IBD标准抗原、阳性和阴性血清,系农业部动物检疫所提供。     

乌骨鸡爆发传染性法氏囊病的诊疗

乌骨鸡爆发传染性法氏囊病的诊疗鸡传染性法氏囊病又称腔上囊炎，是由呼肠孤病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，也是一种免疫机制抑制性疾病，笔者临床上遇到一起爆发，介绍如下。发病情况黄集乡北郭村某农户于１９９５年８月１１日由上海浦东某鸡场购回乌骨良种雏３...     

重组鸡白细胞介素6对不同种类疫苗的免疫增强作用

为评价重组鸡白细胞介素6(rChIL-6)在商品鸡体内对不同种类疫苗的免疫增强作用,采用不同接种方式,应用rChIL-6分别对不同种类新城疫病毒(NDV)单联疫苗和新城疫病毒-传染性支气管炎病毒-禽流感病毒H9亚型三联疫苗(NDV-IBV-H9)进行了免疫增强试验以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)单联油乳剂灭活疫苗的免疫增强田间试验,并进行了将rChIL-6与NDV Ⅳ系预混合乳化制备成的灭活疫苗的免疫试验.结果表明,将rChIL-6与NDVⅣ系、Ⅰ系活疫苗预混合后分别采用滴鼻点眼、肌肉注射接种方式的免疫增强效果优于其他方式;rChIL-6与NDV抗原预混后制备成油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于将相同抗原量的NDV油乳剂灭活疫苗和rChIL-6同时分点免疫接种.rChIL-6对NDV油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于活疫苗,对NDV单联灭活疫苗的免疫增强效果优于NDV-IBV-H9三联灭活疫苗.田间试验表明,rChIL-6对IBDV油乳剂灭活疫苗首免和二免都具有显著的免疫增强作用,二免的免疫增强效果优于首免.这些研究结果为进一步开展新型鸡基因工程免疫增强剂研究奠定了基础.     

金丝桃素的体外抗口蹄疫病毒活性

将体外培养的BHK21细胞感染FMDV后加入金丝桃素,日光灯下光活化1 h,通过细胞病变观察、MTT法、透射电子显微镜观察、H3 UR掺入试验,探讨了光活化金丝桃素对FMDV体外生长增殖的影响。结果表明,金丝桃素有明显的抑制FMDV致BHK21 细胞病变效应,能抑制FMDV的增殖,抑制率可达61.82%。透射电镜观察,金丝桃素组与病毒对照组相比,BHK21细胞的FMDV颗粒明显减少。证实,金丝桃素在体外有明显的抑制FMDV增殖的作用。     

米糠凝集素的部分特性及其抗新城疫病毒作用

采用红细胞凝集试验和观察细胞病变(CPE)的方法分别研究了米糠凝集素的特性和抗病毒作用。结果显示,米糠凝集素能凝集鸡红细胞,促进新城疫病毒对红细胞的凝集,对热有一定的稳定性,耐酸碱;在体外,用米糠凝集素与新城疫病毒作用或用米糠凝集素预处理Vero细胞,均能抑制新城疫病毒在细胞上病变的形成。提示,米糠凝集素具有直接抗新城疫病毒和预防新城疫病毒感染的作用。     

高致病性H7N9流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。     

引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

将从安徽省传染性腔上囊病(IBD)免疫失败的病鸡腔上囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了原核表达质粒pGEX-VP2,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,结果呈阳性反应;SDS-PAGE分析结果显示,重组VP2融合蛋白的分子质量为68ku,表达量约占菌体总蛋白量的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内;Western-blotting结果显示,重组VP2蛋白与IBDV抗体发生反应,形成一条特异性蛋白带,表明获得的重组蛋白具有良好的抗原反应性。     

肉用鸡垂体-肾上腺轴与免疫功能关系的研究

以艾维茵肉鸡为试验动物,研究了垂体-肾上腺轴在传染性腔上囊病病毒(IBDV)强毒株攻击时对免疫系统的调节作用.结果表明,用IBDV强毒株攻击后,试验鸡垂体-肾上腺轴活动加强,血清促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(F)上升,抗IBDV抗体、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素3(IL-3)上升,T淋巴细胞转化率下降.未经IBD疫苗免疫的鸡由于免疫系统遭到IBDV破坏,在IBDV强毒株攻毒后,抗IBDV抗体、IL-2和IL-3的上升幅度均比经IBD疫苗免疫的低.试验鸡血清ACTH和F分别与抗IBDV抗体、IL-2和IL-3呈显著正相关,与T淋巴细胞转化率呈显著负相关,显示机体受病原微生物攻击后垂体-肾上腺轴对免疫系统的调节作用,即增强特异性免疫反应,抑制非特异性免疫细胞的扩增.     

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒(IBDV)的致病机理及研制有效的IBDV疫苗,利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子,对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑,通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测,共选出13个单克隆噬菌斑,经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定,确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV Gx(Gen-Bank登录号:AY444873)VP3的氨基酸序列相同,但二级结构上均以β折叠为主,并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实,筛选的是IBDV VP3的模拟表位。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LN01/08株的分离鉴定

从辽宁省某牛场出现疑似牛传染性鼻气管炎症状的牛鼻拭子样品中分离出一株病毒,该病毒能在MDBK细胞上增殖,能产生牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)典型性细胞病变。通过间接免疫荧光试验、微量血清中和试验、PCR及病毒形态学观察鉴定,证明该分离毒株为IBRV,并被命名为IBRV-LN01/08。根据IBRV的保守区核苷酸序列设计了1对鉴定引物,将扩增的目的片段进行克隆、测序及序列分析。结果表明,该片段序列与GenBank上登录的IBRV K22株的同源性为99.9%。动物回归试验结果显示,6~9月龄IBRV抗体阴性黄牛人工感染IBRV-LN01/08株F3代细胞培养物后,试验动物出现持续体温升高,流鼻涕,鼻内黏膜有白色糜烂溃疡及结节等牛传染性鼻气管炎的临床症状,表明该毒株具有一定的致病性。