一株鸵鸟源新城疫病毒的分离及其分子生物学特性

从2005年山东省某鸵鸟饲养场发病鸵鸟分离出1株新城疫病毒,命名为SD01,采用一步法RT-PCR扩增了该分离株F基因的重要功能区片段(535 bp),并将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,研究了其分子生物学特性。序列分析结果表明,该分离株F基因裂解位点的氨基酸组成与NDV强毒株的特征性结构一致(112R-R-Q-K-R-F117);遗传进化分析表明,该分离株在分类地位上属于基因Ⅶd型,与目前报道的鸵鸟源和其他禽类NDV毒株基因型一样,说明目前我国流行的仍然是NDV基因Ⅶ型。提示,对于鸵鸟新城疫的防治,除进行疫苗免疫之外,采取生物安全措施也是非常重要的。     

鸵鸟新城疫的诊断及病原分离鉴定

陕西某鸵鸟场发生一种以呼吸困难、严重下痢、死亡率高为特征的疫病,经流行病学调查、病理学检查、病毒分离、治疗性诊断确诊为鸵鸟新城疫(ND).从发病鸵鸟分离到1株病毒,经鸡胚传3代,其血凝性逐渐稳定,致死胚均表现皮肤出血;经血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)鉴定为新城疫病毒(NDV),这是陕西省首次从鸵鸟分离到NDV.     

猪源新城疫病毒的分离鉴定

从发生呼吸道症状的病猪鼻腔中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、血凝和血凝抑制试验 ,确定为新城疫病毒。经对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、对鸭胚和鸡、鸭的致死性测定及荧光PCR检测 ,证明分离毒为温和型毒株。     

新城疫病毒Mukteswar毒株反向遗传系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入T7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVT7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVT7按一定比例混合共转染BRS-T7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。     

鸵鸟新城疫病毒的分离与鉴定

鸵鸟新城疫病毒的分离与鉴定花群义张晓丁周晓黎贾建军董俊石世匡（昆明动植物检疫局６５００３４）新城疫（ＮＤ）是鸵鸟的重要传染病之一。本病的特点是发病急，死亡率高，主要危害一年以下的鸵鸟。近年来，我国鸵鸟养殖业得到迅速发展，但ＮＤ严重威胁着鸵鸟业的发展。...     

一株新的鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒的分离鉴定

从进口鸽中分离到1株鸽Ⅰ型副黏病毒,经测定,其鸡胚平均死亡时间(MDT)为59．2 h,鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．92,属于速发型新城疫病毒。通过RT-PCR,扩增出了该分离毒株F基因的重要功能区片段,经测序分析,其裂解位点的氨基酸序列为112RRQKR117F,符合新城疫强毒裂解位点特征。用blastn和blastx分别搜索GenBank的核酸和蛋白数据库,发现它与2株鸽Ⅰ型副黏病毒具有99％的同源性,系统发育进化树分析为基因Ⅵ型。表明,该病毒为1株新的强毒力鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR株不同代次水平的毒力比较试验

为了阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR毒株在体外传代过程中发生的毒力及遗传变异情况,采用第5、10和125代PRRSV-HBR株病毒进行了人工感染试验。结果显示,低代次(第5和第10代)病毒接种组可复制出以"高热综合征"为特点的症候群,第5代毒株感染组死亡率达40%(2/5),第10代感染组症状明显减轻且无死亡,第125代毒株感染组基本无临床症状。这3个代次的毒株感染组于感染后第3天检测病毒血症呈阳性,第7～14天到达高峰,第125代于第21天消失,较第5和10代毒株提前1周。病毒感染后抗原主要分布于脾、扁桃体、淋巴结等组织,第5和10代毒株感染组脏器出现严重的病理损伤,第125代毒株感染组仅见轻微病理损伤。对3个代次毒株的ORF5、ORF6和ORF7测序显示,仅在ORF5出现了3个氨基酸位点突变,即第29位:第5、第10代的缬氨酸到了第125代变为丙氨酸;第32位:第5、第125代的丝氨酸到了第10代变为甘氨酸;第196位:第5、第10代的谷氨酰胺到了第125代变为精氨酸。研究表明,低代次毒株能够完全复制出典型的"猪高热综合征",而高代次毒株无明显临床症状,证明该毒株经细胞传代后毒力下降。高代次毒株感染动物仍能够引起毒血症和持续感染的结果表明,高代次毒株仍具一定毒力,作为疫苗种毒需要进一步毒力弱化。     

新城疫病毒cDNA文库的构建研究

本文报道了用人工合成的28聚寡核苷酸为“引物”,以强毒株新城疫 病毒(NDV)基因组PNA为模板,在逆转录酶作用下成功地合成了NDV- cDNA。后者经琼脂糖凝胶电泳观察,其大小约为0.5～14kb。从凝胶上收集 大于1.0kb以上的cDNA,用Hpa Ⅰ对其进行限制性酶切,然后将酶切片段克隆到pBR322的ScaI位点上,得到的克隆产物即为构建的NDV-cDNA文库。经用少量文库转化E.Coli HB101,得到氨苄青霉素敏感而四环素抗性的转化菌落(Amp基因因外源DNA的插入而失活)。从随机挑出的5个转化菌株中提取重组质粒,经琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段的大小分别为0.8～3.0kb不等。说明所构建的NDV-cDNA文库有效。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。     

四株广东鸽源新城疫病毒的生物学特性

采用RT-PCR方法从广东省分离的4株鸽新城疫病毒中扩增出F和HN基因片段,并对其进行克隆及序列分析,另外对该4株分离株进行了致病指数的测定。结果发现,分离株NDV/GD-1的静脉接种致病指数为1.84,脑内接种致病指数为1.287 5,鸡胚平均死亡时间为78h;NDV/GD-2的静脉接种致病指数为1.55,脑内接种致病指数为1.162 5,鸡胚平均死亡时间为138h;NDV/GD-3的静脉接种致病指数为0.44,脑内接种致病指数为1.35,鸡胚平均死亡时间为126h;NDV/GD-4的静脉接种致病指数为2.51,脑内接种致病指数为1.35,鸡胚平均死亡时间为84h;分离株NDV/GD-2属于基因Ⅱ型;NDV/GD-4属于基因Ⅶd型,与广西株Gxp40亲缘关系最近;NDV/GD-1、NDV/GD-3均属于基因Ⅵ型,与云南分离株Pigeon/China/YN亲缘关系最近;比较分离株与流行的新城疫基因Ⅶ型毒株的F全基因序列以及分离株与常用疫苗株的F、HN全基因序列,发现核苷酸和氨基酸差异较大,证实这4株分离株的生物学特性均有不同程度的差异。     

乌鸡新城疫病毒中发型毒株的分离与鉴定

从发病的 43日龄乌鸡群中分离到 1株病毒 ,经鸡胚传代培养后 ,测定其F3 代尿囊液血凝 (HA)效价为 2 8,HI试验中能被鸡ND阳性血清中和 ,鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 60 .8h ,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 0 .8,血凝解脱时间小于 10min ,血凝素热稳定性差。表明该分离株为新城疫病毒中发型毒株。     

禽流感与新城疫二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒 (AIV)、新城疫病毒 (NDV)基因组序列高度保守区 ,设计合成了 2对引物 ,以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录 ,进行RT PCR特异性片段扩增 ,扩增的片段大小分别为4 70和 32 0bp。结果 ,扩增产物与设计的 2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验 ,AIV、NDV培养物均可扩增至 1 0 - 4,表明本方法对 2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点     

宁夏地区新城疫强毒株的分离与鉴定

1999年 10月— 2 0 0 0年 2月 ,宁夏回族自治区贺兰、平罗县等地区养鸡户鸡群相继出现大规模死亡 ,该地区鸡群均在发病前按常规进行消毒、免疫工作。经检测发病鸡的新城疫 (ＮＤ)血清抑制 (ＨＩ)抗体效价为 1∶12 8— 1∶5 12 ,通过临床检查及实验室诊断 ,确诊该地疫情为ＮＤ强毒株感染所致 ,并分离到 10株ＮＤ强毒株。1　发病情况及临床症状发病鸡多数集中在 2 0— 35日龄 ,发病率为 80 %— 10 0 % ,死亡率为 30 %— 10 0 % ,病程一般为 3— 7ｄ ;发病初期主要以呼吸道症状为主 ,表现为流泪、咳嗽、打呼噜 ,继而死亡 ;耐过的鸡一般呈现神经…     

抗新城疫单克隆抗体的制备与特异性分析

以蔗糖反透析浓缩及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ 200层析纯化Ｆ48Ｅ8和ＬａＳｏｔａ新城疫病毒(ＮＤＶ),取纯化的病毒液免疫接种ＢＡＬＢ ｃ小鼠,将小鼠脾细胞与ＮＳ 1骨髓瘤细胞融合,经次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(ＨＡＴ)培养基选择,间接ＥＬＩＳＡ检测,有限稀释法克隆,筛选出了3株杂交瘤细胞,依次命名为1Ｄ4、1Ｄ5、16Ｇ12。3株杂交瘤细胞的染色体数为80～100,并能稳定传代,其产生的单克隆抗体重链属于ＩｇＧ1,轻链属于κ链;ＥＬＩＳＡ检测时仅与ＮＤＶ发生特异性反应,而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应,应用这些单克隆抗体对ＮＤＶ分离株进行了分群研究。     

雏鸡体内新城疫病毒强毒的荧光定量RT-PCR检测

将新城疫病毒(NDV)强毒H2株经滴鼻感染和同居感染18日龄雏鸡,应用建立的荧光定量RT-PCR检测病毒在雏鸡体内各组织的动态分布.结果显示,滴鼻感染后第6 h,即可在肺、脑、脾、肾和肠5种组织中检出NDV RNA,而12 h后所有组织均能检测到;同居感染12 h后才可在肺、脑、脾和肾4种组织中检出,而24 h后所有组织均能检测到;在上述2种感染途径中,受检组织内的病毒含量从高到低依次为:肺、脑、脾、肾、肠、肝、心脏和腿肌.与普通RT-PCR相比,检测灵敏度相近.     

中国西北地区新城疫病毒分离株基因型与抗原性的关系

从我国西北地区分离到10株新城疫病毒(NDV),在蚀斑纯化、致病力和基因型鉴定的基础上,以LaSota、F48E9株免疫血清与分离毒株进行中和试验和交叉血凝抑制试验(HI).结果表明,弱毒株LaSota的免疫血清对分离毒株具有一定的保护力,但随毒株的不同有很大差异,对分离毒的中和指数远远低于强毒株F48E9免疫血清的中和指数.结合基因型鉴定结果,认为这种差别很可能是造成LaSota系疫苗免疫失败的原因之一.     

鸽新城疫病毒分离株的部分生物学特性鉴定及疫苗免疫试验

从暴发疑似鸽新城疫的某赛鸽场分离到1株病毒,通过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验及鸡胚中和试验初步鉴定为鸽新城疫病毒,进而进行了鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)测定扣对不同动物红细胞的凝集试验,证明该分离株属新城疫强毒力毒株.将该毒株经鸡胚尿囊液增殖后用甲醛灭活,制成油佐剂灭活苗,对鸽免疫后检测其血清抗体水平并进行攻毒试验,结果在免疫后21 d抗体达到高峰,攻毒试验表明油佐剂灭活苗对鸽新城疫病毒感染有较强的保护力.