羊口疮病毒分子生物学的研究进展

羊口疮病毒主要感染山羊和绵羊,近年来发现其也可感染包括人在内的多种动物,为一种人兽共患病。对羊口疮病毒的病原学、基因组结构、应用研究、免疫学特性等方面进行了综述,同时对已鉴定的几种病毒重要免疫调节蛋白和毒力基因及其功能进行了详细阐述,较为深入地探究了羊口疮病毒干扰宿主免疫系统及其免疫逃避的分子机制。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

从发病山羊中分离到 1株羊口疮病毒 ,在犊牛睾丸细胞上产生明显的CPE ,感染 2月龄羊及成年兔均可产生与自然发病相同的症状 ,接种 2日龄小鼠则无任何症状出现 ;电镜观察该病毒颗粒呈椭圆形 ,有囊膜 ,大小在 2 2 5nm× 12 5nm左右     

鸭瘟病毒的纯化及电镜负染形态观察

先做切向超滤浓缩,再采用蔗糖垫底超速离心和蔗糖密度梯度超速离心的方法对鸭胚成纤维细胞培养物中的鸭瘟病毒进行纯化,并对纯化的病毒粒子用电镜进行了观察.结果显示,用切向超滤法将病毒培养物浓缩为原体积的1/5后,再采用300g/L蔗糖垫底超速离心和300～600 g/kg蔗糖密度梯度离心的方法进行纯化,可获得大量的纯化病毒粒子.电镜负染观察结果表明,病毒粒子呈圆形,多数直径为150 nm左右,只有1个核衣壳,少数病毒粒子直径可达300 nm,有2个或多个核衣壳.     

应用SPA-固相免疫电镜法检测口疮病毒

我们在进行骆驼传染性口疮病原分离鉴定研究中,采用SPA—固相免疫电镜法检测口疮病毒,获得较好效果。 (一)材料和方法 1.抗原 (1)骆驼传染性口疮病毒:取自人工感染发病驼痂块,按常规方法作1:10(W/V)稀释,—20℃冻结保存,使用前水浴融化,4000rpm离心30分钟,取上清备用。     

马属动物血小板电镜形态观察

用电镜对马属动物血小板形态结构的研究国内未见报道,本实验用扫描电镜和透射电镜,观察了正常马属动物血小板的形态特点,从而提供了认识血小板功能的形态学基础资料。 (一)材料和方法 1.血样:为临床检查健康的马、驴、骡静脉血。 2.方法:用普通注射器抽取15ml静脉血,等分,分别迅速注入三支离心管中(每支离心管中分别加入3.8％枸橼酸钠、草酸钠、肝素抗凝)混均,1000～500转/分离心10分钟,吸取上层富含血小板血浆(PRP),加等量0.2％戊二醛液混均,静置10分钟,2500转/分离     

猪传染性水泡病病毒形态及其导致细胞病变的电镜观察

1973年起,我所与江苏农科所协作,对猪水泡病病原——南京口岸系毒株进行了电镜观察,包括对病毒的提纯和组织培养工作,取得了一定的结果。但病毒颗粒在细胞内的晶格排列一直没看到,兄弟单位用上海北新泾系毒株接种鼠单层肾细胞,在细胞内观察到了晶格排列的病毒粒子。鉴于上述情况,我们又继续进行了不同毒株病原的电镜观察,探索不同毒株间是否有差异。     

电镜观察禽流感A型病毒

禽流感病毒是引起家禽、野鸟的一种烈性传染病的病原,该病多年来许多地区均有报导,严重危害养禽业。该病毒最早发现于1900年,Contanni等人报道了鸡瘟;相继在1956年Blaskovic等人报道了鸭体病毒;1961年Becker报道了燕鸥体内的病毒;1963年Lang、Wellsc报道了火鸡体内的病毒;1965年Rinaldi、Pereira报道了鹌鹑体内的病毒。由于国际上纷纷报道及其危害性日益加大、引起人们高度     

羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR鉴别检测方法的建立

针对羊痘病毒(capripoxvirus,CaPV)的A29L基因和羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的H3L基因,设计、合成了2对特异性引物以进行二重PCR。结果表明,该方法可以在数小时、在同一反应体系中清晰地区分CaPV和ORFV,其PCR产物大小分别为413 bp和708 bp,与预期的片段大小相符,序列分析证实目的基因序列与已发表的序列一致;该检测方法的灵敏度可达1个病毒蚀斑形成单位(PFU)。采用二重PCR对12株CaPV、ORFV和相关病毒、细菌培养物,以及22份田间样品进行检测,与预期结果完全一致,且与相关病毒或健康羊组织样品无交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可作为临床样品中CaPV和ORFV的鉴定和诊断的有效方法。     

应用免疫电镜技术观察羊流产衣原体

本实验应用免疫电镜技术(IEM)吸附法、装饰法、吸附和装饰结合法以及沉淀法检测羊流产衣原体,并以直接法做对照。实验结果表明,这4种方法适用于检测羊流产衣原体,处理的样品在电镜下均较直接法处理的样品清晰,对于观察羊流产衣原体的形态以及对本病的诊断都有较高的实用价值。(一)材料和方法1.材料:羊流产衣原体(黄株)鸡胚卵黄囊培养物磨碎稀释经差速离心提纯,制成衣原体悬液。羊衣原体阳性血清批号8806,补体结合效价为1:256。阴性血清。上述材料均由我所羊衣原体研究课题组提供。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

应用电镜技术对猪瘟病毒的观察

应用电子显微镜技术早期观察猪瘟病毒,由于该病毒不能在体外增殖而受到了限制,另一方面,由于感染猪本身的组织和血清被其它病原体污染也妨碍了研究,Reagan和他的同事们在感染猪血清中发现病毒粒子为22～30nm(平均为27nm),Ageev在感染该病毒猪红细胞表面上和血清中检出直径为20～44nm球形粒子,经组织培养分离猪瘟病毒的早期报告为20～80nm,但以后对生长在组织培养物上的纯化了的猪瘟病毒报告是球形的,直径为37～67nm,并带有囊膜粒子,偶尔在病毒囊膜上石到呈不规则排列的纤突。     

山羊口疮病毒的纯化

在新疆骆驼口疮病发病地区和未发病地区的绵羊和山羊群中,有与骆驼口疮病相类似的疾病流行,经病毒形态和临床观察,证明骆驼、山羊、绵羊口疮均为痘病毒科副痘病毒属病毒所致。为对三种寄主的病毒的理化特性和血清学关系进一步研究,我们分别对骆驼口疮病     

禽脑脊髓炎病毒的提纯和电镜观察

将禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株、１１４３株和ＮＨ９３７株分别经卵黄囊接种于６日龄ＳＰＦ鸡胚，接毒１０日后解剖鸡胚，收集尿囊液，采集脑、消化道和胰腺，用玻璃匀浆器制备２０％的组织悬液。组织悬液经３次冻融充分破坏细胞，释放病毒，然后以４００Ｏｒ／ｍｉｎ离心２０分钟，１００００ｒ／ｍｉｎ离心４０分钟。上清液经浓缩后轻轻加入已含２ｍｌＣｓＣｌ不连续密度梯度的５ｍｌ离心管内，再以４５０００ｒ／ｍｉｎｌ２℃离心２小时，在ＣｓＣｌ连续密度梯度内取出含ＡＥＶ的组分后经对蒸馏水透析除去ＣｓＣｌ，对聚乙二醇－６０００透析浓缩。病毒样本经１％磷钨酸负染后用透射电镜观察见到典型的ＡＥＶ粒子。     

羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的羊口疮病毒(ORFV)序列(Gu320351),针对OrfV的B2L基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测OrfV的环介导等温扩增技术(LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,用建立的LAMP方法对OrfV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而绵羊痘病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、丝状支原体山羊亚种、山羊痘病毒及健康山羊皮肤的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对OrfV的最低检出量为5.3fg,比常规PCR方法高1 000倍。表明建立的LAMP方法特异性强,敏感性高。对6份临床样本的检测结果显示,OrfV阳性检出率为83.33%(5/6),与常规PCR的符合率为100%。本试验为羊口疮病例的临床诊断和OrfV的快速检测提供了新的方法。     

羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。     

应用离子交换捕捉电镜技术观察动物类冠病毒

(一)材料和方法 1.样品处理:把采自腹泻牛、猪及貉子的粪便,制成10～20％悬液,低速离心,将其上清液直接滴附在碳-福尔马(Formvar)膜或取其上清液1ml,加4滴磷酸氢钙饱和液吸附,低速离心,弃上清,取沉淀,加1μl乙二胺四乙酸二钠(EDTA)饱和液,使磷酸氢钙溶解,将其溶解液滴附在碳-福尔马膜上,用2％磷钨酸(PTA)负染,电镜观察。     

斑节对虾杆状病毒病检疫和病毒电镜观察

本试验采用组织压片法、常规组织切片法、快速组织切片法及电镜观察法对进口的斑节对虾(Penaems mondon)及其繁殖的后期幼体的斑节对虾杆状病毒(P.mondon-type b-aculovirus,MBV》进行诊断。结果,后期幼体MBV包涵体感染率为35％～100％,抽样样品阳性率达100％。嗜酸性的MBV包涵体存在于肝胰腺和前肠的上皮细胞核内,单个、多个、近圆形。电镜观察,其包涵体由多角体蛋白组成,呈拟晶体排列;病毒颗粒呈杆状,有披膜,自由分布于细胞核内或粘附在包涵体上,大小约为360×60nm。     

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断王家富丁建华张楚瑜罗满林（武汉大学生命科学院４３００７２）伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）是由疱疹病毒（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）引起的多种家畜和野生动物的一种急性传染病，尤以对猪的危害最大。该病以母猪繁殖障碍...     

兔病毒性出血症病毒的提纯及电镜观察

本试验用人O型红细胞吸附-释放病毒的方法提纯兔病毒性出血症病毒,通过电镜观察证实了提纯效果。电镜下观察到的病毒颗粒细微结构清晰,大小约30～40nm,背景中杂质极少。     

伪狂犬病病毒北京株的纯化及电镜观察

将伪狂犬病病毒（ＰｒＶ） 北京株细胞培养物经超速离心沉淀后,用质量分数３０ ％ 、３５ ％ 、４０ ％ 、４５ ％ 蔗糖密度梯度离心,收集病毒蛋白带,经１０ ｇ／Ｌ 醋酸铀负染色后电镜观察病毒粒子形态。结果表明,病毒粒子主要集中于３５ ％ ～４０ ％ 蔗糖界面处;有囊膜病毒粒子直径约为１５０ ～２１０ ｎ ｍ ,无囊膜病毒粒子直径约为１００ ～１６０ ｎ ｍ 。证明上述纯化ＰｒＶ 的方法是可行的,为今后建立分泌抗ＰｒＶ 杂交瘤细胞株及开展基因工程抗体的研究奠定了基础