鸭α-干扰素基因疫苗在鸭体内动态分布规律的定量检测

将50、100和200μg pcDNA-SDIFN-α分别肌肉注射28日龄樱桃谷肉鸭,设PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)对照,建立并应用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测了不同时间pcDNA-SDIFN-α在血液以及各组织器官中的含量。结果,建立的PCR具有特异性强、灵敏度高、快速等特点,各剂量pcDNA-SDIFN-α给鸭免疫后的第1 h即可在血液及各组织中检测到,注射部位显著高于除心脏外的其他组织;除血液外其他器官中pcDNA-SDIFN-α的含量在1~24 h达到最高,随后逐渐减少;105 d时各组织仍能检测到(约1×102拷贝/g)。不同剂量pcDNA-SDIFN-α在免疫鸭各组织中的含量的总体规律为200μg>100μg>50μg。表明,pcDNA-SDIFN-α肌肉注射能迅速分布到鸭体各组织器官中并持续存在105 d以上。     

小鹅瘟鸭胚化弱毒疫苗对雏鹅的免疫研究

本试验用自己分离的广东石楼强毒株,经鸭胚培育成一株对雏鹅无致病性,毒力稳定,免疫性良好的小鹅瘟鸭胚化弱毒株。2日龄雏鹅,疫苗使用剂量为100倍释稀,0.5ml/只(50个免疫剂量)肌肉注射,3日龄的雏鹅,疫苗10倍稀释,0.5ml/只(500个免疫剂量)肌肉注射,则分别于注射后6天和3天,均可抵抗50个LD_(50)的小鹅瘟强毒攻击。免疫期暂测到50天。制成的湿苗(鸭胚胚液)可在-15℃冻结保存6个月,4℃保存1个月,室温(28℃)保存3.5天。疫苗连续通过雏鹅5代,毒力未见返强。疫苗在我省12个市县的疫区共注射197860只雏鹅,注射后均无不良反应。亦未发生小鹅瘟。先后三批从不同地区田间注射了疫苗的雏鹅,注射后9～12天抽样回实验室进行强毒攻击,均获得保护。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较

为阐明小鹅瘟基因疫苗与弱毒疫苗诱导细胞免疫和体液免疫的不同机理,将小鹅瘟VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按6μg/只基因枪轰击和100 μg/只肌肉注射,小鹅瘟弱毒疫苗按100 μL/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时以pcDNA3.1(+)和生理盐水为对照.于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77、105 d采集抗凝血,用淋巴细胞转化试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞的转化效果和CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化,另外,在以上10个时间段以及免疫后第133、161、189、217 d分别采集凝血,用间接ELISA检测小鼠特异性IgG抗体水平.结果显示,pcDNA-GPv-VP3免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组.3个免疫组小鼠都能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答,并且基因疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫应答比弱毒疫苗免疫组强.     

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)转染鹅胚成纤维细胞(GEF),每隔12 h检测VP3蛋白的表达情况,同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅,于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105 d采血,进行淋巴细胞增殖试验(MTT法)。结果,转染后第24 h即可在GEF中检测到GPV VP3蛋白,第60 h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490 nm值在免疫后第35 d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14~63 d、第7~63 d的D490 nm值分别与PBS对照组差异极显著;肌肉注射组及基因枪组免疫后第21~49 d的D490 nm值显著高于弱毒疫苗对照组;肌肉注射组及基因枪组免疫后第14~63 d的D490 nm值极显著高于空质粒对照组。表明,基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-GPV-VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。     

鹅感染鸭瘟的诊断

鹅感染鸭瘟的诊断黄宏菁（海南省万宁县畜牧业局５７１５００）６０年代初，国内外曾有鹅感染鸭瘟病毒而引起流行的纪录。但海南地区至今未见类似报道。近日，在本县某养鹅专业户的鹅群发病过程中，经一系列诊断，证实是鹅的鸭瘟，经紧急接种１０倍鸭免疫量的鸭瘟弱毒疫苗...     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列 ,设计、合成了 1对引物 ,以 1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板 ,进行PCR扩增 ,扩增出预期 5 6 3bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMD18 T载体 ,经Amp/IPTG/X gal平板筛选 ,HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定 ,获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定 ,与参考序列比较 ,二者同源性为 99.3%。小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织 (脑、肝、脾 ) ,均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性 ,能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断     

鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭体内的生长动力学检测

为了研究鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭脑、胸腺、脾、肾、肝、法氏囊中的动态分布规律,根据GenBank中鸭瘟病毒的UL6基因设计引物RTF和RTR,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的标准曲线。利用建立的标准曲线对采集组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数进行定量。结果显示,免疫后在脑、胸腺、肝、肾、脾、法氏囊均能检测到鸭瘟病毒DNA,且免疫后第1天至第3周,肝、脑、肾中病毒DNA的拷贝数较其他受检组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数高。免疫后至第9周,鸭瘟病毒DNA检出不稳定。试验结束时,除肾、法氏囊外,其他组织中病毒DNA的拷贝数均下降至1×105copies以下。表明鸭瘟病毒疫苗株对SPF鸭组织具有泛嗜性,其主要分布于SPF鸭脑、肝、肾中。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

应用PCR检测成年鸭体内鸭瘟强毒的分布

鸭瘟病毒 (DPV)强毒经人工接种和同居感染 10 0日龄鸭后 ,应用聚合酶链反应 (PCR)检测病毒在鸭体内各组织器官的动态分布。试验结果表明 ,DPV强毒经肌肉注射进入鸭体后 6h可在肝、脾、血液和粪便中检测到DPVDNA ;DPV强毒经肌肉注射到鸭体后各受检样品被检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、脾、血液和直肠粪便 (6h)→肺、脑和腿肌 (12h)→肾和胸肌 (2 4h) ;同居鸭于混群后 4 8h在肝、肺、血液和直肠粪便中检出DPVDNA ;DPV强毒经同居感染鸭后各受检样品检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、肺、血液和直肠粪便 (48h)→脾和脑 (72h)→胸肌和腿肌 (96h)→肾 (12 0h)。     

不同毒力鸭肝炎病毒对鸭红细胞免疫功能的影响

应用红细胞C3b受体花环(C3bRR)和免疫复合物花环(ICR)试验,测定鸭肝炎病毒强毒株、中毒株和弱毒株对鸭红细胞免疫功能的影响.结果表明,不同毒力毒株对鸭红细胞免疫功能均呈现抑制作用,这种抑制作用与病毒毒力有一定关系,但和接毒时间无关.     

沙门氏菌invH基因的重组表达与免疫保护效果研究

在沙门氏菌invH基因重组表达的基础上,研究invH基因表达蛋白的免疫保护功能。采用PCR技术对鼠伤寒沙门氏菌DT104株的入侵基因H进行扩增,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,将重组克隆进行融合蛋白表达、纯化和Western-blot检测,用油乳剂制备融合蛋白疫苗,将该疫苗通过3种不同剂量(40μg/只、60μg/只、80μg/只)免疫注射小鼠进行免疫保护效果测定,同时设油乳剂灭活疫苗组和PBS空白对照组,采用黏附与黏附抑制试验对抗血清的活性进行分析。结果表明,构建的重组克隆成功表达了44ku的融合蛋白GST-invH,且该蛋白具有良好的免疫原性。3种剂量重组蛋白疫苗间的免疫效果差异不显著,均能提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的含量,与空白对照组差异显著(P<0.05);油乳剂灭活疫苗组的保护率为90%,3种剂量重组蛋白疫苗组的保护率均在60%以上,虽然重组蛋白疫苗的保护效果不及油乳剂灭活疫苗,但与空白对照组差异均极显著(P<0.01)。体外黏附抑制试验结果显示,抗融合蛋白GST-invH的抗体能抑制沙门氏菌对靶细胞的黏附。表明,GST-invH融合蛋白具有良好的免疫保护性。     

鸭瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的研制

将鸭瘟病毒(DPV)CHv株经过鸭胚成纤维细胞增殖、反复冻融、差速离心和蔗糖密度介质离心制备纯化抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法,并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件,研制了相应的检测试剂盒并对盒内各组分的保存条件、质量控制以及试剂盒的特异性、重复性进行了研究。结果显示,4.75μg/孔的纯化DPV抗原包被反应板可获得良好的特异性和敏感性,1∶100稀释的待检血清样品反应后D405 nm值换算为抗体效价的标准直线方程为y=1.573 3.552x(r=0.953,n=40)。试剂盒在4℃保存3个月或-20℃保存10个月后各项性能都很好。应用该试剂盒对皮下注射、口服和滴鼻免疫DPV弱毒的20日龄樱桃谷鸭血液中抗DPV特异性IgG抗体效价进行了测定,皮下免疫鸭于第6 d,口服和滴鼻免疫鸭于第9 d可在血清中检测到DPV特异性抗体,且至第60 d时依然可检测到高效价抗体。证实,该试剂盒可用于鸭瘟的血清流行病学调查和鸭场免疫抗体水平的监测。     

鸭传染性浆膜炎油佐剂灭活疫苗的研究

以1、2型鸭疫里默氏菌分离株为菌种研制了1型鸭传染性浆膜炎单价油佐剂灭活疫苗和1、2型鸭传染性浆膜炎二价油佐剂灭活疫苗.经过无菌及安全检查合格后,对7日龄雏鸭经颈部皮下接种0.5 mL/只,免疫后14、24 d用相同血清型强毒攻击,保护率达90%～100%.单价疫苗免疫后2周内,抗体水平持续上升,从第3周开始缓慢地下降,5周时仍然维持在较高水平.通过攻毒保护试验和抗体消长规律的测定表明,鸭传染性浆膜炎油佐剂灭活疫苗具有良好的免疫保护作用.     

乳牛流行热弱毒疫苗和灭活疫苗的比较

对牛流行热灭活疫苗和弱毒疫苗的免疫效果及其对乳牛体温、产奶量的影响和局部反应进行了试验研究。结果显示 ,乳牛流行热弱毒疫苗免疫后 12个月仍有 77.8%可获得坚强保护 ,而灭活疫苗有 66.7%可获得保护 ;弱毒疫苗注射后局部皮肤肿块比灭活疫苗小 ,对产奶量的影响也小于灭活疫苗。总体来看 ,弱毒疫苗的免疫效果好于灭活疫苗     

猪流行性腹泻弱毒疫苗的研究

用从广州地区流行性腹泻病猪分离并适应到Ｖｅｒｏ等传代细胞的猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）Ｇ１强毒株，通过Ｖｅｒｏ、ｐＫ１５、ＳＴ细胞株的连续传代，证明第７２代毒已被致弱。用８３代毒（Ｐ８３）对吃初乳前的小猪以８～１０ｍｌ剂量口服连续传５代，每代都从接种猪小肠取样接种细胞进行培养鉴定，并于增殖后作为次代接种材料，结果５代毒均未引起小猪发病，证实该代次毒株的安全、稳定，达到了常规弱毒疫苗株要求的标准。用Ｐ８３制成弱毒疫苗，对２２头８～１０日龄小猪进行免疾效力试验，１４头口服免疫，８头颈肌注射免疫，剂量均为２ｍｌ／头。免疫后２１ｄ以最小发病量（即原毒液的１：１２稀释液）及原毒液的２倍、４倍和８倍的稀释液经口进行强毒攻击，对照组１２头也以相对剂量同时攻击。结果免疫组仅口服免疫、经大于最小强毒攻击量６倍剂量攻击组中１头（１／２）有一过性轻微腹泻，发病不到２４ｈ即恢复。对照组的１２头中有１０头典型发病，严重腹泻，并有寒颤等症状，病程长达３～６ｄ，７ｄ后腹泻症状消失，但体况明显削瘦。试验证明Ｐ８３制备的弱毒疫苗的总免疫效力达９４．６％，表明Ｐ８３已具备弱毒疫苗株的要求。     

兔瘟病兔脏器红细胞凝集价和抗体消长规律的测定

(一)材料和方法 1.试验用兔: (1)健康兔:选自兔瘟非疫区,未经免疫,HI阴性的青年大耳兔,体重1.5～2kg。 (2)免疫兔:经HI测定为阴性的健康青年大耳兔,体重1.5～2kg,用兔瘟组织灭能苗1ml皮下注射免疫。 (3)人工发病兔:用以上健康兔每兔颈部皮下注射种毒0.1g为人工发病兔。 2.种毒:兔瘟人工发病,经菌检阴性,有典型病变兔的肝脏以PBS配成1:10(g/v)组织悬液,经双抗处理,作为人工发病种毒。 3.其他反应成分:     

人参皂甙Rg1对弓形虫P30融合蛋白免疫效果的影响

将120只ICR小鼠随机平均分为6组,除生理盐水对照组、P30融合蛋白免疫对照组和P30融合蛋白+弗氏佐剂免疫对照组外,其余3组分别在P30融合蛋白中按10、50、100μg/kg加入人参皂甙Rg1。将ICR小鼠皮下多点注射融合蛋白及融合蛋白与不同免疫佐剂的混合液,健康对照组用PBS代替;2周后以相同剂量和途径加强免疫一次。结果表明,人参皂甙各剂量组均能显著提高淋巴细胞的增殖水平和机体对融合蛋白的免疫应答水平;P30融合蛋白+弗氏佐剂免疫组的免疫保护效果最好;3个不同剂量人参皂甙组中以P30融合蛋白+50μg/kgRg1免疫组的保护效果最好。     

适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。     

检测鸭甲型肝炎病毒3型的免疫组织化学方法的建立和应用

收集鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV3)接种10日龄鸭胚后死亡胚体的尿囊液,用差速离心法获得纯化的DHAV3抗原免疫家兔后制备家兔抗DHAV3超免疫血清,提取家兔抗DHAV3IgG,成功建立和优化了检测DHAV3的免疫组织化学方法。该法能够检测DHAV3感染雏鸭肝组织的病毒抗原,阳性信号主要分布于受感染细胞的细胞质,而用它检测鸭瘟病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病死亡雏鸭和健康雏鸭时则呈现阴性反应。应用该方法对临床确诊并经福尔马林溶液保存的5份DHAV3感染雏鸭的肝、脾、肾、小肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺的样品进行检测,结果均为阳性。以上试验结果表明,该方法具有良好的特异性,可用于DHAV3感染雏鸭的临床诊断和福尔马林溶液固定样品的回顾性诊断。     

鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗的研究

以 1、2、10型鸭疫里氏杆菌 (RA)分离株为菌种 ,研制鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗。经无菌及安全检验合格后 ,对 6日龄樱桃谷雏鸭颈部皮下接种 0 .4mL/只 ,免疫后第 10、14、2 1和 3 5d分别用 1、2、10型RA强毒株攻击 ,第 14d的攻毒保护率为 91.7%～ 10 0 % ,3 5d的攻毒保护率为 66.6%～ 83 .3 %。田间试验结果表明 ,雏鸭 5～ 7日龄免疫后至上市保护率可达 95 .0 %～ 10 0 %。