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通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。 相似文献
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采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4~5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。 相似文献
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利用定点突变技术,将A型产气荚膜梭菌α毒素(CPA)第68位组氨酸(CAT)定点突变成甘氨酸(GGT),构建了含CPA突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pMCPA-H68G含有CPA-His68Gly突变基因,且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的31.65%。应用EXPASY服务器上的SOPMA法对CPA和CPA-His68Gly突变体分子进行二级结构的预测,同时模拟了其三级结构。结果显示,CPA和CPA-His68Gly突变体的二级结构主要是由α螺旋和无规则卷曲组成的,三级结构非常相似。 相似文献
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从 12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了 18株病原菌 ,经生化试验及毒素中和试验 ,确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列 ,设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和 β2共 6对分型毒素基因的引物 ,对以前昆明地区分离的 1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增 ,结果扩增出了与预期大小相同的 6个基因片段 ,分别为 2 33、196、32 4、4 46、5 6 7和 6 6 5bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型 ,较细菌毒素检测方法快速 ,与细菌分离鉴定的结果一致。 相似文献
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鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析 总被引:2,自引:0,他引:2
为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较.结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭工菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法.经对亚型分布情况进行分析.表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型.证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析. 相似文献
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PCR是 1985年兴起的一项基因体外扩增技术。十多年来在生命科学研究领域发挥了前所未有的作用。 1990年Williams等[1] 在PCR技术的基础上建立了一种新的揭示基因组多态性的方法 ,即随机扩增多态性DNA (RAPD)技术。虽然RAPD技术诞生的时间短 ,但由于它具有快速灵敏、程序简便等优点 ,所以在短时间内就被广泛应用。1 RAPD技术的原理及分子机制1.1 RAPD技术的原理RAPD技术是建立在PCR技术的基础上。它利用一系列 (通常数百个 )不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链 (一般为 10碱基聚合体 )为引物 ,对所研究的基因组DNA进行P… 相似文献
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牛产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌引起的条件性高度致死性传染病 ,其特征是发病急 ,病程短 ,死亡快。本病病原血清型主要是A型 ,也有C型和D型。 2 0世纪 90年代 ,该病在我国频繁发生 ,给养牛业造成较大经济损失。为探讨本病的病理变化特征和发展规律 ,给诊断该病提供科学依据 ,笔者对病原分离鉴定为产气荚膜梭菌的自然病死牛的组织病理学变化进行了观察。1 材料和方法1.1 病料采集 对经流行病学调查、临床症状观察疑似产气荚膜梭菌病的自然病死牛立即解剖 ,无菌采集肝、脾、肠系膜淋巴结以及病变小肠 15cm以上 ,系统观察各实质脏器的… 相似文献
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20 0 2年 6月 ,甘肃省金昌市金川区某鹿场饲养的梅花鹿发生一种以排血样稀粪并伴有神经症状的疾病 ,共发病 5头 ,全部死亡。根据流行病学特点、临床症状、剖检变化及实验室检验 ,确诊为A型产气荚膜梭菌病。1 发病情况及症状该养鹿场自 2 0 0 1年 4月起 ,先后从东北引进良种梅花鹿 12 5头 ,以后又繁殖 70多头 ,分群分圈舍饲 ,鹿群生长发育良好。该场远离村庄 ,有较为合理健全的兽医卫生管理制度 ,对鹿群定期注射羊痘、羊三联四防苗等疫苗。从 2 0 0 2年 6月初开始 ,主要饲喂青苜蓿。 6月 18日早晨 1头公鹿发病 ,虽采取多种措施治疗 ,但未奏… 相似文献