猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

绵羊肺炎支原体P113蛋白C端重复区的表达及其免疫原性

为进一步研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的结构与功能,在进行生物信息学分析的基础上,对编码其C端重复区的基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blotting方法对P113蛋白的免疫原性进行了分析。结果显示,P113蛋白与猪肺炎支原体黏附素P97蛋白高度同源,并具有相似的C端重复区;该区域在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以可溶性的形式存在;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P113蛋白是良好的免疫原。     

猪肺炎支原体黏附特性及黏附因子的研究进展

猪肺炎支原体是引起猪慢性呼吸道疾病的主要病原体,其感染后常导致继发感染而使病情加重,该病给世界各地的养猪业造成巨大的经济损失。研究表明,猪肺炎支原体在入侵后对呼吸道的黏附是其致病过程中的重要步骤,本文就猪肺炎支原体的黏附特性作一阐述,主要包括黏附相关的P97、P102和P110等黏附因子的介绍。     

A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70～81位、118～140位,VP1 G-H环131～157位、C末端188～212位,A/WH/CHA/09 VP1 43～48位、VP3 55～72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。     

绵羊肺炎支原体P108蛋白的分子特征分析及免疫原性研究

为进一步探究绵羊肺炎支原体P108蛋白的结构及其免疫原性,在进行生物信息学分析的基础上,对编码P108的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p108基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp385的核苷酸同源性较高,扩增的p108部分基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;重组蛋白可以与山羊抗绵羊肺炎支原体血清发生结合反应,表明P108蛋白是免疫原之一。本研究结果表明P108蛋白可以诱导机体产生免疫应答,是建立绵羊肺炎支原体感染血清学诊断技术的潜在抗原。     

猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-P97,用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光试验检测重组P97蛋白在AD-293和PK15细胞中的表达。之后,用Ad-P97抗血清检测Mhp对宿主细胞的黏附作用以及Ad-P97在仔猪体内的免疫应答反应。结果显示,P97基因由3 339个核苷酸组成,共编码1 113个氨基酸,其核苷酸序列高度保守;重组P97蛋白可在Ad-P97感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达,但Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变;Ad-P97具有良好的免疫原性,能抑制Mhp对PK15细胞的黏附作用,诱导免疫仔猪产生Mhp凝集抗体。上述结果为进一步研制安全、高效的Mhp重组疫苗奠定了基础。     

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。     

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

非洲猪瘟CD2v胞外区基因片段的真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS载体中,获得pCAGGS-CD2v胞外区重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染293F细胞,获得重组胞外CD2v蛋白(简称His-CD2v)。用Ni-NTA柱纯化His-CD2v,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用ELISA和间接免疫荧光对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,(1)His-CD2v融合蛋白在293F中以可溶形式表达,SDS结果显示,相对分子质量约为35~80 ku的弥散带;(2)融合表达的His-CD2v能与阳性血清反应,与对照不反应;(3)HisCD2v制备的多抗效价最高达1∶218700,且能与阳性血清竞争性结合CD2v抗原。上述结果表明,His-CD2v融合蛋白的表达及其多抗的成功制备,为进一步筛选CD2v特异性单抗及研制竞争ELISA试剂盒,为非洲猪瘟感染与免疫鉴别方法的建立奠定了坚实的基础。     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强( );与4E4、1H11反应中度( );与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。     

口蹄疫病毒3A蛋白和FLAG标签的融合表达与血清学分析

通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OZK 3A蛋白的93～102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,采用ELISA和Western-blot分析融合蛋白的血清学反应活性。结果表明,3A蛋白和3AF蛋白均能在大肠杆菌中有效表达,且主要以可溶性形式表达。纯化的3AF蛋白能与FLAG单抗特异性反应而未能诱导免疫小鼠产生针对该标签的抗体,体现了体外和体内的生物反应性差异。FLAG标签对3A蛋白的表达水平、表达形式等未产生显著影响。本研究为下一步FLAG标记病毒的拯救及其应用奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒ORF2 C-端主要抗原区的克隆及原核表达

为研究猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2C-端主要抗原区的原核表达产物是否具有抗原性,用PCR技术对猪戊型肝炎病毒ORF2C-端基因进行扩增,经克隆与序列分析,发现该基因片段编码289个氨基酸残基。将该目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,转化表达菌BL21(DE3),成功构建了重组质粒pET-HEV-ORF2-C,其重组菌于37℃、0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后,菌体裂解物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为34ku处出现一新蛋白带,与预期的目的蛋白分子质量相符。质谱鉴定表明,成功地表达了HEV-ORF2C-端蛋白。Western-blot和抗体效价检测分析结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性。     

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定.结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2b、IgG2b、IgM和IgM.采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白.     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌TOP10,经IPTG诱导,成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDS PAGE分析,在分子质量50.4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDS PAGE分离,并经透析得到了重组融合蛋白,以此融合蛋白免疫家兔,制备并纯化了抗pGH多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。