副猪嗜血杆菌Neu基因的克隆表达及表达产物的免疫原性

为研究副猪嗜血杆菌(HPS)基因工程疫苗,以HPS5型毒株为模板,通过PCR扩增获得副猪嗜血杆菌神经氨酸酶(Neu)全基因,将其克隆至pMD18-T载体并对其进行测定和分析。结果表明,Neu全基因含一个2187bp的开放阅读框,编码一含729个氨基酸的蛋白,与Neu基因参考序列(登录号:NZ-ABKM01000006)的同源性为99.0%。以pMD-Neu基因为模板,重新设计引物,扩增得到HPSNeu蛋白的部分编码区,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。将pET-Neu在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,经SDS-PAGE分析,重组蛋白Neu主要以包涵体形式表达,分子质量为52ku;Western-blot分析表明,重组蛋白Neu能与阳性血清发生特异性抗原反应。将纯化重组蛋白Neu试验性注射免疫昆明小鼠,攻毒试验结果显示,氢氧化铝佐剂组的保护性较低,仅有10%;而弗氏佐剂组具有较高的保护性,保护率高达60%。     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a( )载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。     

副猪嗜血杆菌部分体内诱导基因的筛选

用Sau3AⅠ酶切副猪嗜血杆菌(HPS)SC-1株基因组,回收500～2000bp的片段,并与pRSETa/b/c载体连接,构建了HPSSC-1株基因组表达文库;将攻毒后不同时间的猪血清混合,分别与体外培养的HPSSC-1和大肠杆菌BL21的全菌、超声裂解产物及热变性裂解产物进行吸附,用ELISA检测吸附效果,并用Western-blot进一步验证;再用经过吸附的混合血清对HPSSC-1基因组表达文库进行菌落原位免疫杂交筛选;对筛选出来的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果显示,构建的副猪嗜血杆菌基因组文库库容量为1.2×104CFU;混合血清经过吸附后,D450nm由0.384下降到0.220。Western-blot结果显示,经吸附的血清与HPSSC-1株超声裂解产物无任何条带;通过原位免疫印迹筛选获得5个阳性克隆;阳性克隆测序结果经DNAMAN分析初步推测出5个可能具有生物学意义的开放阅读框,BLAST分析表明,这些序列与GenBank中的副猪嗜血杆菌相应基因的同源性在99%以上,分别涉及副猪嗜血杆菌的酪氨酸磷酸酯酶、异亮氨酰-tRNA合成酶、荚膜多糖输出蛋白及2个假定蛋白。结果表明,应用体内诱导抗原技术从副猪嗜血杆菌SC-1株基因组表达文库中成功筛选出5个阳性克隆,其中部分基因可能与毒力相关。     

副鸡嗜血杆菌B型分离株免疫原性的比较和疫苗株的筛选

利用分离自我国不同地区的3株B型副鸡嗜血杆菌菌株及0222标准株分别制作油乳剂灭活疫苗免疫无鸡传染性鼻炎病史的鸡群,通过攻毒保护试验和HI抗体测定,分析比较了其免疫原性,以筛选适用于制备疫苗的菌株。结果表明:不同地区的分离株在致病性和免疫原性上存在一定的差异,TJ-1株疫苗免疫鸡对TJ-1和DL-1株的保护作用可达90%和91.7%,对BJ-1株的保护率为63.6%,具有相对较好的保护作用,目前可以作为疫苗株使用。在各免疫组试验鸡中,0222株和BJ-1株免疫鸡群的血清抗体水平较高,但这可能与血凝抑制试验所采用的抗原是由0222株制备的及BJ-1株在抗原性上可能更接近于0222株有关。DL-1和TJ-1株疫苗免疫鸡的抗体水平都很低,但其免疫保护却要强于0222和BJ-1株疫苗免疫鸡。由此说明B型株因菌株之间免疫原性的差异使得HI抗原的选择难度增加。     

猪源札幌病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性检测

为获得猪源札幌病毒(SaV)衣壳蛋白(VP1),以SaV CH430株的RNA为模板,采用RT-PCR扩增VP1基因;将其克隆到原核表达载体pET-30a中,并将成功构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果显示,获得的VP1基因全长为1 635bp,编码545个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,目的条带大小为63ku,与预期结果相符。重组菌在37℃、IPTG终浓度为0.8mmol/L、诱导表达6h时重组蛋白的表达量达到最大值,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。将纯化的VP1重组蛋白免疫家兔,得到了超免疫血清。Western-blot分析表明,该重组蛋白与超免疫血清具有良好的反应原性。上述试验结果为深入研究VP1蛋白的功能和研制ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白部分抗原表位基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为获取具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒S蛋白,并能有效研究其免疫原性,从山东省猪流行性腹泻病毒感染的某猪场病料中扩增S蛋白基因具有免疫原性的4个片段(Sa,Sb,Sc和Sd)。将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将表达的蛋白免疫家兔以研究其免疫原性。结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件的最佳诱导时间为8h,IPTG的最佳终浓度为1.0mmol/L。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,四个表达产物的分子质量分别约为61ku(Sa)、46ku(Sb)、41ku(Sc)、43ku(Sd)。经琼脂扩散试验测定,它们免疫后效价分别约为24(Sa)、25(Sb)、22(Sc)、24(Sd)。该研究表明,表达的4段蛋白均具有免疫原性,这为后期亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)基因的原核表达和免疫原性分析

为研究A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)蛋白亚单位疫苗在鸡体的免疫保护力,利用笔者所在实验室已构建的含M2e基因的质粒pGEM-T-1459,获得顺次串联的基因片段3M2e,将其克隆到原核表达载体pMAL-C2x中,经酶切和DNA测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,表达出一分子质量为60 ku的可溶性融合蛋白(MBP-3M2e),与预期值相符,该蛋白表达量约占菌体表达量的59.8%。间接免疫荧光和间接ELISA检测结果显示,用纯化后的融合蛋白免疫的SPF鸡血清可与流感病毒的M2蛋白发生反应,且其抗体效价较高,表明纯化后的重组融合蛋白具有良好的免疫原性。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2 -NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPc)基因。测序分析表明,所克隆的羊PrPc基因片段大小为771 bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21(DE3),挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明,PrP基因在大肠杆菌中成功表达,并能被抗牛PrPc单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%~45%,目的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

马动脉炎病毒膜蛋白基因截短型的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列,设计合成了 1 对引物,从 pUC 18 M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及 pGEX 6P 1 载体双酶切并连接,成功构建了原核表达载体pGEX 6P Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化;诱导后菌体裂解物经 SDS PAGE分析发现,在约 34 ku处出现了 1条特异性的蛋白条带,其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符,并随着诱导时间的延长而变化,在诱导后4 h达到高峰。结果表明,膜蛋白 M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。